PCR.
Fundamento.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que se basa en la replicación de ADN.
Con ello se consigue multiplicar exponencial mente un fragmento de ADN, consiguiendo una gran cantidad de copias de dicho fragmento. Se utiliza ADN polimerasa que puede actuar en altas temperaturas , a unos 95º C, la necesaria para la desnaturalizar el ADN y poder separar las cadenas. La polimerasa más usada es la Taq polimerasa, procedente de la bacteria Thermus acquaticus.
Materiales.
- Gradilla.
- Vaso de precipitado.
- Tubos esppendorf.
- Micropipeta 50 microlitros.
- Centrifuga
- Pipeta graduada de 5 ml y otra de 2 ml
Reactivos.
- Suero salino.
- Matriz instagene
Muestra.
- Células mucosa de la boca.
Procedimiento.
- En un tubo de ensayo le añadimos con un pipeta 3 ml de solución salina.
- Después con un bastoncillo cojo la muestra de la boca y el bastoncillo lo deposito en el tubo de ensayo con la solución salina y lo dejo durante un minuto.
- Saco el bastoncillo y deposito 1,4 ml de la mezcla anterior en un sppendorf y lo centrifugo en la centrifuga para sppendorf a 8000 rpm durante 5 minutos.
- Decantar el sobrenadante con cuidado.
- Añadimos 70 microlitros de matriz instagene y lo resuspendemos con la micropipeta.
- Lo incubamos durante 10 minutos a 100 ºC y después lo dejamos durante unos minutos a temperatura ambiente .
- Centrifugamos la muestra a 1300 rpm durante 30 segundos.
- Pasamos 10 microlitros del sobrenadante a un microtubo lo rotulamos y lo congelamos.
- En un tubo sppendorf le depositamos 18,5 microlitros de agua destilada + 2 microlitros de oligo 1 + 2 microlitros de oligo 2 + 2,5 microlitros de ADN y le damos un golpe de centrifuga
- Tenemos que preparar un gel de agarosa y la electroforesis.
- El gel lo preparamos de la siguiente forma : primero cojo un reloj de vidrio y se pesa 0,45 g de agarosa y en un probeta ponemos unos 20 ml de agua destilada y se hecha la agarosa y enrasamos hasta los 30 ml y lo pasamos a un vaso de precipitado. Lo metemos en el microondas hasta que se disuelva completamente, no debe quedar ningún grupo, por último lo dejamos enfriar a 50 ºC. Al gel de agarosa le añadimos 1,5 microlitros de colorante (Redsafe nucleic acid stainig solution)
- Cuando ya hemos terminado el gel lo pasamos a la cubeta de la electroforesis que ya esta previamente sellada, después le ponemos los peines en la parte del cátodo negativo y otro peine en el medio. Cuando la gelatina ya este fija le quitamos los peines y así los pocillos se quedan marcados
- Los pocillos que están en los extremos son los controles, que lo llenamos con tampón de carga con azul de metileno ( 5 microlitro de tampón de control + sacarosa+agua ) y los pocillo que están en el centro los de arriba se llenan con tampón de carga ( depositamos en una probeta 900 microlitros de glicerina mas 25 mg de azul de metileno y lo ensaramos hasta 10 ml con agua destilada) y la parte inferior con Tampón tae ( 100 microlitros deTAE mas 900 microlitros de agua destilada ).
