Reacción en cadena de la polimerasa (13/05/2015)

PCR.

Fundamento.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que se basa en la replicación de ADN.

Con ello se consigue multiplicar exponencial mente un fragmento de ADN, consiguiendo una gran cantidad de copias de dicho fragmento. Se utiliza ADN polimerasa que puede actuar en altas temperaturas , a unos 95º C, la necesaria para la desnaturalizar el ADN y poder separar las cadenas. La polimerasa más usada es la Taq polimerasa, procedente de la bacteria Thermus acquaticus.

Materiales.

• Gradilla.
• Vaso de precipitado.
• Tubos esppendorf.
• Micropipeta 50 microlitros.
• Centrifuga
• Pipeta graduada de 5 ml y otra de 2 ml 

Reactivos.

• Suero salino.
• Matriz instagene

Muestra.

• Células mucosa de la boca.

Procedimiento.

1. En un tubo de ensayo le añadimos con un pipeta 3 ml de solución salina.
2. Después con un bastoncillo cojo la muestra de la boca y el bastoncillo lo deposito en el tubo de ensayo con la solución salina y lo dejo durante un minuto.
3. Saco el bastoncillo y deposito 1,4 ml de la mezcla anterior en un sppendorf  y lo centrifugo en la centrifuga para sppendorf a 8000 rpm durante 5 minutos.
4. Decantar el sobrenadante con cuidado.
5. Añadimos 70 microlitros de matriz instagene y lo resuspendemos con la micropipeta.
6. Lo incubamos durante 10 minutos a 100 ºC y después lo dejamos durante unos minutos a temperatura ambiente .
7. Centrifugamos la muestra  a 1300 rpm durante 30 segundos.
8. Pasamos 10 microlitros del sobrenadante a un microtubo lo rotulamos y lo congelamos.
9. En un tubo sppendorf le depositamos 18,5 microlitros de agua destilada  + 2 microlitros de oligo 1 + 2 microlitros de oligo 2 + 2,5 microlitros de ADN y le damos un golpe de centrifuga 
10. Tenemos que preparar un gel de agarosa y la electroforesis.
11. El gel lo preparamos de la siguiente forma : primero cojo un reloj de vidrio y se pesa 0,45 g  de agarosa y en un probeta ponemos unos 20 ml de agua destilada y se hecha la agarosa y enrasamos hasta los 30 ml y lo pasamos a un vaso de precipitado. Lo metemos en el microondas hasta que se disuelva completamente, no debe quedar ningún grupo, por último lo dejamos enfriar a 50 ºC. Al gel de agarosa le añadimos 1,5  microlitros de colorante  (Redsafe nucleic acid stainig solution)
12. Cuando ya hemos terminado el gel lo pasamos a la cubeta de la electroforesis que ya esta previamente sellada, después le ponemos los peines en la parte del cátodo negativo y otro peine en el medio. Cuando la gelatina ya este fija le quitamos los peines y así los pocillos se quedan marcados 
13. Los pocillos que están en los extremos son los controles, que lo llenamos con tampón de carga con azul de  metileno ( 5 microlitro de tampón de control + sacarosa+agua ) y los pocillo que están en el centro  los de arriba se llenan con tampón de carga  ( depositamos en una probeta 900 microlitros de glicerina mas 25 mg de azul de metileno y lo ensaramos hasta 10 ml con agua destilada) y la parte inferior con Tampón tae ( 100 microlitros deTAE mas 900 microlitros de agua destilada ).

Práctia LXIV: P4 (28/05/2015)

PRUEBA CRUZADA MAYOR.

Fundamento.

Esta práctica consiste en enfrentar suero del paciente con los  hematíes del donante ,para poder saber si son compatibles para una transfusión. Primero se realiza en un medio salino, después en un medio albuminosos y por último lo enfrentamos al suero de Coombs.

Materiales.

• Tubo de hemólisis.
• Centrífuga.
• Baño de agua.
• Pipetas Pasteur.
• Gradilla .
• Reloj.

Muestra.

• Plasma del receptor.
• Suspensión de hematíes del donante al 5%.

Para obtener la suspensión de hematíes lo primero que  realizamos es el lavados de los hematíes.

Para ello depositamos 1 ml de sangre y lo completamos con 3 ml de solución salina, lo agitamos y lo centrifugamos a 2000 rpm durante 4 minutos. Después desechamos el sobrenadante y volvemos a realizar el paso anterior 2 veces más. En la última centrifugación que realizamos desechamos el sobrenadante y preparamos hematíes al 5%. En un tubo depositamos 5 gotas (250 microlitros) de los hematíes lavados y 5 ml de suero fisiológico lo agitamos y así obtenemos una suspensión al 5 %.

Reactivos.

• Solución salina fisiológica.
• Albumina bovina al 30%
• Suero de Coombs.

Procedimiento.

1. Depositamos en un tubo de hemólisis una gota de suspensión de  hematíes del donante y dos gotas de plasma del receptor. Lo mezclamos y lo dejamos reposar durante 2 minutos.
2. Centrifugamos a 3000 rpm durante 1 minuto.
3. Leemos el resultado, es decir observamos si hay aglutinación en el caso de que se observemos un botón hemático no debemos seguir con la práctica ya que indica que son incompatibles.Pero si no observamos el botón hay que seguir. ( Cuando realice la práctica se observo el botón hemático por lo que no tuvimos que realizar los pasos siguientes )
4. Añadimos al tubo 3 gotas de albúmina, lo mezclamos y lo incubamos a 37ºC durante 30 minutos.
5. Centrifugamos a 3000 rpm durante 1 minutos y observamos si hay aglutinación, si no se observa el botón hemático debemos seguir la práctica.
6. Lavamos los hematíes con suero fisiológico tres veces.
7. En el último lavamos desechamos correctamente el sobrenadante y depositamos una gota de suero de Coombs y mezclamos bien.
8. Centrifugamos a 1000 rpm durante 2 minutos, y por último leemos los resultados.
9. Si se observa el botón hemático indica incompatibilidad y si no hay aglutinación en ninguno de los pasos indica que son compatibles.

Hoja de trabajo.

1. ¿Qué se enfrenta en la prueba cruzada mayor?

Se enfrenta el suero del receptor con los hematíes del donante.

2.¿ Cuándo se debe realizar la prueba cruzada menor?

Sólo se realiza cuando se transfunde una gran cantidad de plasma, ya que en este caso, la presencia de anticuerpos en la sangre del donante puede ser peligroso.

3. ¿Por qué debemos realizar la prueba en medio salino y albuminoso?

Para detectar todos los anticuerpos presentes.

4.¿ Qué pone de manifiesto el suero antiglobulina  de Coombs ?

Los anticuerpos que se hayan quedado fijados a la membrana eritrocitaria.

Resultado.

	Resultado.
Medio salino.	Se observa el botón hematico.
Medio albuminoso	No se ha realizado
Suero antiglobulina	No se ha realizado

Valoración de los resultados.

Las sangres analizadas son:

Incompatibles.

Práctica LIV: P2 (22/05/2015)

DETERMINACIÓN RÁPIDA DE HEMOGLOBINA.

Fundamento.

El objetivo de esta práctica es determinar la concentración de hemoglobina antes de una donación. 

Para poder donar, la sangre del donante tiene que ser más densa que una solución de sulfato de cobre y caer libremente a través de ella.

Materiales.

• Lanceta
• Gasas
• Vaso de precipitado.

Reactivo.

• Alcohol.
• Solución de sulfato de cobre a una densidad de 1,052 g/dl.

Para hacer sulfato de cobre debemos disolver 17 g de sulfato de cobre en 100 ml de agua destilada, lo añadimos en un matraz aforado de 100 ml y después de haberlo enrasado le añadimos 0,74 ml de agua destilada para obtener la misma densidad a una temperatura ambiente de 22ºC. Por último mezclar 51 ml de la solución de sulfato de cobre (solución madre) con 49 ml de agua destilada.

Muestra.

Sangre capilar.

Procedimiento.

1. Añadimos la solución de sulfato de cobre en un vaso de precipitado de 50 ml.
2. Con una lanceta pinchar en el pulpejo del dedo.
3. Dejamos caer una gota de sangre con algo de impulso sobre la solución de sulfato de cobre.

Hoja de trabajo.

1. ¿Cuál es el valor mínimo de hemoglobina que debe tener una mujer antes de la donación ?

12,5 g/dl.

2.¿ Con qué otra solución comparamos la densidad de la sangre?

Con una solución de sulfato de cobre  a una densidad de 1,050g/dl

Resultado.

 La gota de sangre ha caído libremente a través de la solución de sulfato de cobre.

Valoración de los resultados.

El donante es pato : Si.

Práctica LXII: P4 (13/05/2015)

DETERMINACIÓN DE UN Du.

Fundamento.

Para poner de manifiesto al Du ( antígeno D débil ) debemos sensibilizar los hematíes problema con un suero que tiene anticuerpos anti-D y después enfrentarlo al suero de Coombs. 

Debemos realizar una prueba de Coombs indirecta.

Material.

• Tubos de hemólisis.
• Centrífuga.
• Pipeta Pasteur.
• Gradilla
• Baño de agua.
• Reloj.

Reactivos.

• Suero anti-D humano.
• Suero antiglobulina humana de conejo ( suero de Coomb) .
• Solución salina fisiólogica.

Muestra.

Suspensión de hematíes al 5%.

Para obtener la suspensión de hematíes lo primero que  realizamos es el lavados de los hematíes.

Para ello depositamos 1 ml de sangre y lo completamos con 3 ml de solución salina, lo agitamos y lo centrifugamos a 2000 rpm durante 4 minutos. Después desechamos el sobrenadante y volvemos a realizar el paso anterior 2 veces más. En la última centrifugación que realizamos desechamos el sobrenadante y preparamos hematíes al 5%. En un tubo depositamos 5 gotas (250 microlitros) de los hematíes lavados y 5 ml de suero fisiológico lo agitamos y así obtenemos una suspensión al 5 %.

Procedimiento.
En un tubo de hemólisis depositamos una gota de suero anti-D y un gota de suspensión de hematíes al 5%. Lo mezclamos suavemente y lo incubamos a 37ºC durante 30 minutos. Después de incubar lavamos los hematíes, para ellos completamos el tubo con 3 ml de suero fisiológico y lo centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minutos, después desechamos el sobrenadante y volvemos a realizar el paso anterior 2 veces más. En la última centrifugación que realizamos desechamos completamente la solución salina y añadimos sobre el sedimento una gota de suero de Coombs y lo mezclamos. Por último centrifugamos el tubo a 1000 rpm durante 1 minuto.

Para evitar falsos positivos debemos realizar una prueba de Coombs directa de los hematíes problemas. Para ello realizamos los siguientes pasos:

1. Depositar en un tubo de hemólisis 1 ml de suspensión de hematíes problema.
2. Lavar los eritrocitos. Añadimos el tubo con suero fisiológico y lo centrifugamos a 1000rpm durante 1 minuto. Después desechamos el sobrenadante y volver a realizar el paso anterior 2 veces más. En el último lavado desechamos el sobrenadante.
3. Resuspender el sedimento que queda después del ultimo lavado.
4. Añadir 2 gotas de suero antiglobulina.
5. Centrifugamos al mezcla a 3000 rpm durante 1 minuto.
6. Observar si hay o no aglutinación.

Hoja de trabajo.

1. ¿Qué contiene el suero de Coombs?

Suero antiglobulina humana.

2. ¿Qué se detecta con la prueba directa ?

Intentamos detectar anticuerpos incompletos que han sensibilizado a los hematíes in vivo. 

3. ¿Qué podemos detectar con la prueba indirecta?

Se busca anticuerpos incompletos libres en el suero, o poner de manifiesto la presencia de antígenos débiles en la membrana de los hematíes.

4.¿ Qué buscamos en la sangre del paciente?

La presencia del antígeno Du.

5.¿ Qué ocurre si el control es positivo?

Que es Rh positivo y para evitar falsos positivos se realiza la prueba de Coombs directa con los hematíes problema.

Resultado obtenido.

	Aglutinación.
Tubo 1	Si aglutinación

Valoración de los resultados.

La sangre es: Rh positivo

Práctica LXI: P4 (07/05/2015)

DETERMINACIÓN DEL FENOTIPO Y GENOTIPO DEL SISTEMA Rh.

Fundamento.

El objetivo de esta práctica es investigar el genotipo del sistema Rh mediante el  enfrentamiento de los hematíes problema con diferentes antisueros dirigidos contra los antígenos que forman el sistema Rh.

Material. 

• Tubos de hemólisis.
• Centrífuga.
• Rotulador de vidrio.
• Pipetas Pasteur.
• Gradilla.

Reactivos.

• Suero anti-D.
• Suero anti-E
• Suero anti-C
• Suero anti-e
• Suero anti-c
• Solución salina fisiológica.

Muestra.

Suspensión de hematíes lavados al 5 %.

Para obtener la suspensión de hematíes lo primero que  realizamos es el lavados de los hematíes.

Para ello depositamos 1 ml de sangre y lo completamos con 3 ml de solución salina, lo agitamos y lo centrifugamos a 2000 rpm durante 4 minutos. Después desechamos el sobrenadante y volvemos a realizar el paso anterior 2 veces más. En la última centrifugación que realizamos desechamos el sobrenadante y preparamos hematíes al 5%. En un tubo depositamos 5 gotas (250 microlitros) de los hematíes lavados y 5 ml de suero fisiológico lo agitamos y así obtenemos una suspensión al 5 %.

Procedimiento.
Lo primero es rotular cinco tubos, cada uno con la letra D, C, E ,c y e. En cada tubos añadimos una gota del antisuero correspondiente  y una gota de la suspensión de hamatíes a 5%. Lo mezclamos suavemente. y por último centrifugamos todos los tubos a 1000 rpm durante 1 minuto.

Hoja de trabajo.

1.¿ Qué antisueros se utilizan en esta técnica ?

• Suero anti-D.
• Suero anti-E
• Suero anti-C
• Suero anti-e
• Suero anti-c

2.¿Por qué no existe suero anti-d ?

Porque no existe el antígeno d.

3.¿Qué expresan los cinco resultados obtenidos?

Los cinco resultados obtenidos expresan el fenotipo de la sangre analizada.

4. Si la sangre es Rh + , ¿puede determinarse exactamente su genotipo con respecto al sistema Rh?

No, si la sangre es Rh positivo (D+) existen varios genotipos posibles que dan lugar al fenotipo previamente detectado.

5.Si los resultados obtenidos son: D-, C-, E+, c+ y e- ; ¿ cuál es el genotipo posible de esta sangre?

Según nomenclatura de Fisher- Race los genotipos posibles son: dcE / dcE

Resultado obtenido.

Tubo	Aglutinación
D	-
C	+
E	+
c	+
e	no.

Valoración de los resultados.

El/los genotipo/s posible/s del sistema Rh en la sangre analizada es/son: dCe / dcE y  dCE/ dce

Práctica LX: P4 (5/05/2015)

DETERMINACIÓN DEL GRUPO Rh EN TUBO.

Fundamento.

El objetivo es la detección  del antígeno D en la superficie de los hematíes enfrentándolo a un suero anti-D.

Materiales.

• Tubos de hemólisis.
• Rotulador de vidrio.
• Gradilla.
• Pipeta Pasteur.
• Centrífuga.

Reactivos.

• Suero anti-D.
• Albúmina bovina al 30%
• Solución salina fisiológica.

Muestra.

Suspensión de hematíes al 5%.

Para obtener la suspensión de hematíes lo primero que  realizamos es el lavados de los hematíes.

Para ello depositamos 1 ml de sangre y lo completamos con 3 ml de solución salina, lo agitamos y lo centrifugamos a 2000 rpm durante 4 minutos. Después desechamos el sobrenadante y volvemos a realizar el paso anterior 2 veces más. En la última centrifugación que realizamos desechamos el sobrenadante y preparamos hematíes al 5%. En un tubo depositamos 5 gotas (250 microlitros) de los hematíes lavados y 5 ml de suero fisiológico lo agitamos y así obtenemos una suspensión al 5 %.
 Procedimiento.
Primero rotulamos dos tubos, una con la letra D y otro con la letra A. El en tubo D le depositamos una gota de suero anti-Dy en el tubo A le depositamos una gota de albumina bovina al 30% y agitamos. A los dos tubos le depositamos una gota de la suspensión de hematíes al 5%3 y agitamos los tubos. Por último centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minuto.

Hoja de trabajo.
1. ¿Por qué utilizamos el control de albúmina?
Porque si aparece aglutinación en ese tubo se debe repetir la prueba pero usando un suero anti-D en medio salino. El tubo con albúmina debe dar siempre negativo.

2.¿ Que ocurre si no aparece aglutinación en el tubo D ?
Si no produce aglutinación en ninguno de los dos tubos procedemos a incubar ambos a 37ºC durante media hora. Posteriormente centrifugamos a 1000 rpm durante un minuto y observamos si existe o no aglutinación. En el caso de persistir la negatividad comprobaremos que le paciente no posee un Du ( D débil) mediante una prueba de Cooms indirecta.

3. ¿Que debemos detectar mediante un Coombs indirecto ?
La presencia de un Du (D débil )

4. ¿Cómo se prepara la muestra problema?

Para obtener la suspensión de hematíes lo primero que  realizamos es el lavados de los hematíes.

Para ello depositamos 1 ml de sangre y lo completamos con 3 ml de solución salina, lo agitamos y lo centrifugamos a 2000 rpm durante 4 minutos. Después desechamos el sobrenadante y volvemos a realizar el paso anterior 2 veces más. En la última centrifugación que realizamos desechamos el sobrenadante y preparamos hematíes al 5%. En un tubo depositamos 5 gotas (250 microlitros) de los hematíes lavados y 5 ml de suero fisiológico lo agitamos y así obtenemos una suspensión al 5 %.

Resultado obtenido.

	Aglutinación.
Sección D	Aglutinación
Sección A	No aglutina.

Valoración de los resultados.

La sangre analizada es:

Rh positivo

Práctica LIX: P4 (5/05/2015).

DETERMINACIÓN DEL GRUPO Rh EN PORTA.

Fundamento.
La finalidad de esta práctica es la detección del antígeno D en la superficie de los hematíes problema empleando anticuerpos Anti-D. En el caso de contener el antígeno D se observara aglutinación.

Materiales.

• Portaobjetos.
• Pipeta pasteur.
• Rotulador de vidrio.
• Palillos.
• Visualizador luminoso.

Reactivos.

• Suero anti-D
• Albúmina bovina al 30 %.

Muestra.

 Sangre anticoagulada.

Procedimiento.

Lo primero que hay que hacer es dividir el portaobjetos en dos partes, en el lado izquierdo marcamos con la letra S (suero ) y en el derecho con la letra A (albúmina ). Con una lanceta pinchamos el pulpejo del dedo, previamente desinfectado con alcohol, y con un capilar tomamos la sangre.

Depositamos una gota de suero anti-D en el lado izquierdo marcado con la  letra S (suero) y en el lado derecho marcado con la letra A (albúmina) depositamos una gota de albúmina bovina al 30 %.

En los dos lados del portaobjeto, a lado de la gota de suero anti-D y la albúmina depositamos una gota de sangre y con palillos distintos mezclamos ambas partes. Por últimos colocamos el portaobjeto en el visualizador luminoso que favorece la mezcla de sangre y reactivo y observamos si hay aglutinación.

Hoja de trabajo.

1. ¿Qué tipo de muestra empleamos en esta técnica?

Determinación del grupo Rh en porta.

2. ¿Para qué se utiliza el visualizador ?

Para favorecer la mezcla de sangre y reactivos y también para observar mejor el resultado de la reacción

3. ¿Qué puede dar lugar a falsos aglutinaciones?
Aparición de pequeños coágulos de fibrina.

4. ¿Qué ocurre si aglutina la sección A ?
No podemos informar del resultado de la prueba.

Resultado obtenido.

	Aglutinación.
Sección S	+
Sección A	-

Resultado Mesa 1

Valoración de los resultados.

La sangre analizada es : Rh positivo.

Gráfica.