Práctica XLI :P3 (9/03/2015).

DETERMINACIÓN FUNCIONAL DE FIBRINÓGENO.

Fundamento.
El fibrinógeno se transforma en fibrina en presencia de exceso de trombina. El tiempo de formación del coagulo en esta practica es inversamente proporcional a la concentración de fibrinógeno presente ne la muestra del plasma. En presencia de altas concentración de trombina el tiempo de formación del coágulo en el plasma es inversamente proporcional a la concentración de fibrinógeno.

Materiales.

1. Pipeta graduada.
2. Micropipeta.
3. Cubetas de coagulometro.
4. Coagulometro.
5. Gradilla.

Reactivos.

• R1 : Trombina Bovina.

• R2: Tampón imidazol.

• R3: Solución caolín.

• Coagulation Cal.

Muestra.

Plasma pobre en plaquetas.

Procedimiento.

• Dilución 1/10 con la muestra (PPP) y R2 ( tampón imidazol) .Sería 50 microlitros de muestra más 450 microlitros de R2.
• Tomamos 5 tubos y lo rotulamos según su concentración, que sería 1/40, 1/30.1/20,1/10,1/5.

En el tubo 1/40 se le añade 3,9 ml de R2 y 100  microlitros de coagulation.

En el tubo 1/30 se le añade 2,9 ml de R2 y 100 microlitros de coagulation.

En el tubo 1/20 se le añade 1,9 ml de R2 y 100 microlitros de coagulation.

En el tubo 1/10 se le añade 0,9 ml de R2 y 100 microlitros de coagulation.

En el tubo 1/5 se le añade 0,4 ml de R2 y 100 microlitros de coagulation.

•  Añadimos  200 microlitros de cada dilución en cubetas de coagulometro y se le añade 20 microlitros de R3 y lo atemperamos a 37º durante 4 minutos.
• Añadimos 100 microlitros de reactivo R1 y cronometrar la formación del coágulo.

Hoja de trabajo.

1º. ¿ De qué tipo es la determinación de fibrinógeno realizada en esta práctica?

Esta práctica se basa en la medición del tiempo que tarda un exceso de trombina en degradar a fibrina el fibrinógeno presente en un PPP diluido y, por tanto, en formar un coagulo.

2º. ¿A qué concentración está la trombina bovina?

A una concentración de 100 U NIH/ml.

3º. ¿A qué dilución se somete a la muestra?

A 1/10

4.º¿Cuál es la fibrinogenemia normal?
La fibrinogenemia normal oscila entre los 150 y los 450 mg/dl.

Resultados obtenidos.

Curva del fibrinogeno.

Dilución del plasma calibrador.	Concentración.	Tiempo en el que coagula.
1/40	0,25*xC	48,5
1/30	0,33*xC	37,4
1/20	0,5*xC	9,4
1/10	1*xC	142,7
1/5	2*xC	7

Tiempos obtenido en el coagulómetro.

Tiempo, en segundos, en el que coagula la muestra:

10 segundos.

Valoración de los resultados.

La fibrinogenemia es:
Normal.

Práctica XLV : P3. (10/3/20154)

PRUEBA DE MEZCLA CON PLASMA NORMAL.

Fundamento.

En esta práctica vamos a mezclar en cantidades iguales de pool de plasma y plasma pobre en plaquetas anormal, para determinar el tiempo de protrombina.

Materiales.

1. Gradilla,
2. Cubeta de coagulometro.
3. Trocitos de acero.
4. Un rotulador de vidrio.
5. Una coagulometro.
6. Un micropipeta de de 100 microlitros.
7. Una baño de agua.
8. Tubo de ensayo de plástico.

Reactivos.

• Solución de cloruro calcico 0,025 M
• Una cefalina activa con ácido elagico.
• Pool de plasma normales.

Muestra.

Plasma pobre en plaquetas.

Procedimiento.

1. Lo primero que hay que hacer es mezclar 100 microlitros de pool de plasma con 100 microlitros de plasma pobre en plaquetas anormal.

PPP anómalo.	100 uL
Pool de plasma normales o Plasma control normal.	100 uL
Dilución.	1/2

1. Lo incubamos en el baño de agua a 37ºC durante 60 minutos.
2. Tomamos 200 microlitros de cloruro calcico añadimos en un tubo de plastico y lo incubamos en el baño durante 5 minutos a 37 ºC.
3. Tomamos dos cubetas de coagulometro, le introducimos en trozo de acero y lo rotulamos como M1 y M2.
4. A las cubetas M1 Y M2 le añadimos 100 microlitros de la dilución anterior ( 100 microlitros de PPP anormal y 100 microlitros de pool de plasma) y también le añado 100 microlitros de cefalina.
5. En el coagulometro lo ponemos en la celda adecuada y le ponemos encima en tapón rojo y se le añade 100 microlitros de cloruro calcico después le pulso Reser y empieza a contar el tiempo que tarda en coagula; el mismo proceso se realiza para la cubeta M2.

Resultado.

M1: 60segundos.
M2:68 segundos.

Hoja de trabajo.

1.º ¿Cuándo debe hacerse una prueba de mezcla con plasma normal?

Se practica generalmente cuando en el plasma problema se determina un TP normal y un TTPA alargado. En estas circunstancias se supone que el paciente sufre un déficit de algún factor de la vía intrínseca y, en concreto , de los factores VII, IX,XI o XII.

2.º Si tras la mezcla con plasma normal, no se corrige el TTPA, ¿ qué se debe investigar?

Si el TTPA de la mezcla no se corrige con respecto al del PPP problema puro, el trastorno coagulatorio se debe a otros motivos como, por ejemplo , a la actuación de sustancias inhibidoras de la coagulación.

Resultados obtenidos.

Tras la mezcla del plasma problema anómalo con plasma normal:
Se ha corregido el TTPA.

Valoración de los resultados.

La prueba realizada indica:

La ausencia de algún factor de la vía intrínseca de la coagulación en el plasma anómalo.

Pruebas que investigan la coagulación. (2 /03/2015)

Tiempo de coagulación.

Fundamento.

Determinar el tiempo que tarda en coagularse la sangre en un capilar.

Materiales.

• Capilar sin heparina.
• Baño de agua.
• Lanceta.
• Algodón.

Reactivo.

Alcohol.

Muestra.

Sangre venosa sin anticoagulante.

Procedimiento.

1. Se sitúa la muestra dentro de un tubo de vidrio.
2. Se incuba a 37º C.
3. Se cuenta el tiempo trascurrido desde el deposito de la sangre en el tubo hasta la aparicion de un coagulo en el interior del tubo.
4. Los valores normales se sitúan entre los 5- 10 minutos.

Resultado.

Se tardo 3 minutos.

Esta prueba ya esta en desuso.

Práctica XXVI:P3 (2/03/2015)

DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR (VSG)

Fundamento.

La sangre se coloca en un tubo que esta dispuesto verticalmente, de este modo la sangre por acción de la gravedad se desplaza hacia el fondo del tubo. Este proceso normalmente es lento porque la acción con la que es atraído los hematíes es casi compensada por la fuerza ascendente creada por el plasma al desplazarse hacia arriba.

Materiales.

1. Pipeta de vidrio desechable que agrega en su interior una embolo de aspiración de plástico.
2. Una gradilla
3. Un tubo con citrato sódico con tapón de goma perforable.
4. Reloj.

Reactivos.

Citrato sódico 3,8 %

Muestra.

Sangre fresca.

Procedimiento.

Lo primero que debemos de hacer es llenar el tubo con citrato sódico con sangre fresca, después lo mezclamos agitando suavemente y por boca del tubo le introducimos la pipeta desechable que se debe llenar con la sangre hasta el algodón. Realizar la lectura a la primera hora y ala segunda hora.

Resultado.

• Sexo del paciente : Varón.

Primera hora = 5 mm

Segunda hora=10 mm

Valoración de los resultados.

Teniendo en cuenta el sexo del paciente, la VSG obtenida es:

Normal.

Hoja de trabajo.

1.º ¿Cómo se llama la carga electrostática negativa de los glóbulos rojos?

Potencia Z.

2.º ¿Qué anticoagulante es el más apropiado para realizar una determinación de la VSG?

Citrato sodico al 3,8 %

3.º ¿ A que temperatura se recomienda practicar la determinación de la VSG ?

A temperatura ambiente a unos 27º

4º. ¿Qué ocurre si la pipeta de VSG esta inclinada durante la determinación?

Que no bajara al mismo ritmo que si lo esta verticalmente bien.

5º. ¿En que circunstancia fisiologica aumenta la VSG?

En presencia de patología aumenta en la vejez y a partir del tercer mes de embarazo.

6º. ¿A que tiempos se efectúa la lectura del VSG?

A la primera y segundo hora.

Práctica XXXIX :P3 (4/03/2015) .

DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA (TTPA)

Fundamento.
Esta práctica se realiza introduciendo en un tubo PPP (plasma pobre plaquetas) y añadiendo cloruro cálcico utilizando el coagulómetro.
El sustituto del factor 3 plaquetario es un dilución fosfolipida creada con cerebros de conejo llama cefalina.

Material.

• Una gradilla.
• 2 cubetas.
• 2 trocitos de acero.
• Un rotulador.
• Micropipeta de 100 microlitros.
• 7 puntas de micropipeta.
• Un coagulómetro.
• 4 tubos de ensayo de plástico.

Reactivos.

• Cloruro cálcico.
• Cefalina activada.
• Pool de plasmas normales.

Muestra.

Un plasma pobre en plaquetas (PPP).

Procedimiento.

Lo primero que hacemos en centrifugar la sangre a 3000 rpm durante 10 minuto para obtener plasma pobre en plaquetas. Rotular dos cubetas, uno con la letra M ( de muestra) y otro con la letra C ( de control). Añadimos con una micropipeta 100 microlitros de muestra al tubo M y 100 microlitros de plasma control normal en el tubo C; también se le añade 100 microlitros de cefalina. En las dos cubetas le introducimos un trocito de acero y lo dejamos alentar en las celdas del coagulómetro 2 minutos. Por último en el coagulometro, se coloca la cubeta en la celda adecuada y se le añade 100 microlitros de cloruro cálcico para que el magnetoagitador se ponga en marcha y comience la lectura.

Hoja de trabajo.
1º. ¿De dónde se obtiene el sustituto de f3p?
De una suspensión de fosfolípidos, obtenida a partir de cerebros de conejo, que recibe el nombre de cefalina.

2º.¿Cómo se llama el sustituto del f3p?
Se llama cefalina.

3º.¿Qué activadores de los fatores de contacto se pueden utilizar?
Como activadores de los factores de contacto se pueden utilizar varias sustancias, entre las que cabe destacar : el caolín, el polvo de vidrio, el sílice, el celite y el ácido elágico.

4º. ¿Cuántos segundos debe superar el TTPA de la muestra al del control para ser considerado anormal?
Se considera anormal un TTPA de la muestra superior, en más de 8 segundos, al del control.

Resultado obtenido.
TTPA de la muestra:
116,6 segundos.

TTPA del control.
28,1 segundos.

Diferencia entre el TTPA de la muestra y el TTPA del control :
116-28,1 = 88,5 segundos.
Cociente entre el TTPA de la muestra y el TTPA del control:
116,6/28,1 =4,4 segundos.

Valoración de los resultados.
La muestra ensayada tiene un TTPA:
Alargado.

Práctica XXXVI:P3 (5/03/2015)

PRUEBA DE RUMPEL-LEEDE.

Fundamento.
Esta práctica ofrece información sobre la fragilidad capilar.

Material.

• Un rotulador.
• Un esfigmomanómetro,
• Un fonendoscopio.
• Un reloj.

Procedimiento.

1. Lo primero que hay que hacer es medir la presión arterial.
2. Trazamos un circulo de unos 5 cm de diámetro en la cara anterior del antebrazo.
3. Colocar el esfigmomanómetro en el brazo donde se ha pintado el circulo.
4. Insuflar aire del maguito del  esfigmomanómetro hasta ejercer una presión equivalente a la presión arterial media de la persona que esta realizando la prueba.
5. Mantenerlo durante 5 minutos.
6. Aflojar y retirar el esfigmomanómetro.
7. Contar la petequias que hayan aparecido en el interior del cirulo.

Forma de tomar la presión.

Resultado.

Resultado de la presión arterial es de:

Presión sistólica : 10

Presión diastolica: 6

La media es 8.

No se ha observado ninguna petequia.

Hoja de trabajo.

1º, ¿Cuánto tiempo se deja puesto el esfigmomanómetro en esta prueba ?

Durante 5 minutos.

2º. ¿Cómo se aprecian las petequias?

Como pequeñas manchas cutáneas de color rojizo.

3º. ¿Cuántas petequias debe contener el círculo para que el resultado sea claramente positivo?

Si hay mas de 20 de petequias.

4º. ¿En qué enfermedades hay una prueba de Rumpel-Leede positiva ?

En las trombocitopenias, en la enfermedad de von Willebrand, en el escorbuto y, sobre todo, en las púrpuras vasculares.

Resultado obtenidos.

El número de petequias aparecidas dentro del círculo es :

Menor de 10.

¿Han aparecido petequias fuera de la cara anterior del antebrazo? : No

¿Tienden a confluir la petequias ? No

Valoración de los resultados.

El resultado de la prueba es : Negativo.

¿Tiene el paciente una fragilidad capilar aumentada? No.

Práctica XLI : P3 (4/03/2015)

DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE PROTROMBINA (TP).

Fundamento.
En esta práctica el reactivo que vamos a utilizar es la tromboplastina histia y del calcio , que recibe el nombre de trombloplastina calcica.
El tromboplastina histica proviene de extractos de cerebro o pulmón de animales.

Materiales.

• Una gradilla.
• Cubeta de coagulómetro.
• Un trocito de acero.
• Rotulador de vidrio.
• Una micropipeta de 100 y 200 microlitros.
• Puntas de pipeta.
• Un coagulómetro.
• Un baño de agua.
• 2 tubos de ensayo de plastico.

Reactivos.

• Tromboplastina cálcica.

Muestra.

Plasma pobre en plaquetas (PPP).

Procedimiento.

Lo primero que hay que hacer es homogeneizar el reactivo sin agitarlo bruscamente.  También debemos atemperar el reactivo y la muestra para ellos podemos meterla en un baño a 37 º durante 5 minutos o tenerla en la mano duran unos minutos.Cuando la muestra  y el reactivo estén atemperados añadimos a una cubeta con una micropipeta 100 microlitros de plasma pobre en plaquetas, que previamente lo hemos conseguido centrifugando la sangre a 3000 rpm durante 10 minutos, y la rotulamos con la letra M; en otra cubeta añadimos 200 microlitros del reactivo (tromboplastina cálcica), el reactivo se tiene que incubar para ello lo colocamos en la celdas del coagulómetro durante 3 minutos. Colocamos la cubeta con la muestra y el reactivo en las celdas del coagulómetro y lo ponemos  en PTT. La cubeta con la muestra la debemos colocar en la celda de medida del coagulómetro y ponerle el tapón rojo encima, y se pulsa el botón de "RESERT" y  en ese momento se le añade con una micropipeta 200 microlitros del reactivo teniendo en cuenta que la punta de la pipeta no puede tocar el tapón rojo porque si lo toca el coagulómetro para de contar, cuando se le añade la tromboplastina cálcica se pone en marcha el magnetoagitador del coagulómetro y comienza la lectura de éste. Cuando se forma el coagulo el coagulómetro finaliza la lectura y nos indica el tiempo que pasa desde la adición de la tromboplastina cálcica.

Interpretación.

Hoja de trabajo.

1º. ¿Qué índice expresa la sensibilidad de una tromboplastina hística?

El ISI.

2º.¿ Cómo se llama la ratio de protrombina corregida?

Se denomina INR.

3º. ¿Cuál es el % normal de actividad de la protrombina?

El 100 -5 de actividad de protrombina.

4º. ¿En qué circunstancias se altera el TP?

Resultado obtenido.

TP de la muestra , en segundos:

37,2 segundos.

% de la actividad de la protrombina contenida en la muestra, obtenido mediante interpolación en la curva actividad preparada previamente:

50%

TP del plasma control normal no diluido (el de 100% de actividad ):

12,3 seg.

Ratio entre el TP de la muestra y el TP del control:

1,32

ISI de la tromboplastina hística utilizada:

1,24

INR=(TP del plasma del paiente/TP  de un plasma control anormal ) ^ ISI
INR = (37,2/12,3)^1,24=3,94

Valoración de os resultados.

La muestra ensayada tiene un TP:

Normal.

Práctica XL: P3 (6/03/2015).

PREPARACIÓN DE UNA CURVA DE ACTIVIDAD DE LA PROTROMBINA.

Fundamento.
Debemos realizar una bateria de diluciones, para obtener con el coagulometro el TP del plasma puro y de cada una de sus diluciones para realizar la curva.

Material.

• 8 tubos de ensayo de plástico.
• Rotulador de vidrio.
• Una pipeta graduada de vidrio de 1 ml.
• Una micripipeta de 100 y 200 microlitros.
• 7 puntas de micropipeta.
• 5 cubetas de coagulómetro.
• 5 trocitos de acero especiales para depositar en el interior de las cubetas.
• Un coagulómetro.
• Una gradilla.

Reactivos.

• Solución salina al 90 %.
• Una tromboplastina cálcica.
• Un pool de plasma normales.

Procedimiento.

Lo primero que hicimos en el pool de plasma, tomamos plasma congelado de otros años los atemperamos a 37º y los añadimos todos en un vaso de precipitados, y por último lo añadimos en los tubos de spenderfor.

Después tomamos 5 tubos de ensayo de plástico y los rotulamos con el porcentaje de actividad asignado a cada dilución que serían un tubo rotulado con 100 , otro con el de  50, otro con el de  33, otro con  25 y el último con el de 10.

Al tubo rotulado con % de actividad 100 le añadimos con una micropipeta 200 microlitros de pool de plasma ; al tubo 50 le añadimos 200 microlitros de pool de plasma y 200 microlitros de solución salina al 0,85 % ;al tubo 33 le añadimos 200 microlitros de pool de plasma y 400 microlitros de solución salina al 0,85%; al tubo 25 le añadimos 200 microlitros de pool de plasma y 600 microlitros de solución salina al 0,85% ; al tubo 10 le añadimos 200 micrilitros de pool de plasma y con una pipeta graduada de vidrio le añadimos 1,8 ml de solución salina al 0,85%.

Cuando ya tenemos los 5 tubos con pool de plasma y solución salina, con una micropipeta vertemos 100 microlitros de plasma puro y de cada una de sus diluciones en las cubetas rotuladas con el %de actividad que le corresponde. A cada una de las 5 cubetas le añadimos un trocito de acero.

Estas cinco cubetas las colocamos en la celdas que hay en el coagulómetro y en otra cubeta añadimos tromboplastina cálcica. En el coagulómetro le tenemos que añadir a cada cunbeta 200 microlitros de tromboplastina calcica.

Hoja de trabajo.

1º. ¿Con qué se diluye el pool de plasmas normales o el plasma control normal?

Con solución salina al 0,85 %

2º. ¿Qué porcentaje de actividad se asigna a la dilución del plasma control de 1/2?

 50 % de actividad.

3º. ¿ Cuándo se pone en marcha la lectura del coagulómetro?

Añadiendo a las diluciones 200 microlitros de tromboplastina cálcica.

4º. ¿Qué se anota en el eje de ordenadas?

Los valores en segundos del TP del plasma control no diluido y de cada una de sus diluciones.

Resultado obtenido.

	Tiempo de Protrombina (PT)
Plasma control no diluido (de 100% de actividad)	12 segundos
Plasma control diluido a 1/2 (de 50% de actividad)	19 segundos.
Plasma control diluido a 1/3 (de 33% de actividad)	25,3 segundos.
Plasma control diluido a 1/4 (de 25% de actividad)	32,4 segundos.
Plasma control diluido a 1/10 (de 10% de actividad)	65,1 segundos.

Práctica XXXVIII: P3 (3/03/2015).

DETERMINACIÓN DEL TEST DE HOWELL.

Fundamento.
Esta práctica se realiza añadiendo plasma rico en plaquetas en dos tubos de ensayo y se le añade cloruro cálcico. El resultado de este test es el tiempo comprendido desde que se le añade loruro cálcico hasta que se coagule la muestra.

Materiales.

• Rotulador de vidrio.
• 2 tubos de hemólisis de vidrio.
• Micropipeta de 100 microlitros.
• Baño de agua.
• Cronómetro.

Reactivos.

• Solución acuosa de cloruro sódico a una concentración del 0,85 %p/v.
• Solución de cloruro cálcico 0,025 M.
• Plasma control normal.

Muestra.

Un plasma rico en plaquetas (PRP).

Procedimiento.

Lo primero que se hace es centrifugar la sangre a 1000 rpm durante 10 minutos para conseguir plasma rico en plaquetas. Atemperamos la muestra y el reactivo a 37º y rotulamos un tubo con la letra M (muestra) y otro con la letra C (control). Depositamos dos tubos en el baño de agua , y vertemos con una micropipeta 100 microlitros de muestra y solución salina al tubo M y al tubo C le añadimos 100 microlitros de control comercial y de solución salina. A la mezcla anterior le agregamos 100 microlitros de  CaCl2 y tenemos que poner en marcha el cronómetro.A los dos tubos que están dentro del baño de agua lo tenemos que coger de la parte superior e inclinarlos hacia delante y hacia atrás, hasta que se observe enturbiamiento y una solidificación en los tubos de muestra y control. Cuando se observe ese enturbiamiento en los dos tubos paramos el cronómetro y ese es el tiempo que tarda en coagular la muestra y el control.

Resultado obtenido.
Tiempo que tarda en coagular la muestra:
130 segundos.
Tiempo que tarda el coagular el control:
115 segundos.

Hoja de trabajo.

1º. ¿Qué tipo de muestra se utiliza en esta prueba?

Plasma rico en plaquetas.

2º. ¿A qué concentración está el CaCl2 empleado en este test ?

A una concentración del 0,85% p/v.

3º. ¿Cuáles son los valores normales del test de Howell?

Los valores normales están comprendidos entre los 90 y 130 segundos.

4º. ¿Qué tratamiento puede ser controlado con este test?

En terapias con heparina.

Práctica XXXVII: P3 (2/03/2015).

DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE HEMORRAGIA CON LA TÉCNICA DE DUKE.

Fundamento.
El tiempo de hemorragia es el tiempo que transcurre desde una lesión hasta la formación del trombo blanco plaquetario.

Material.

• Algodón. 
• Un portaobjeto.
• Una lanceta.
• Papel de filtro.
• Un cronómetro.

Reactivo.

Alcohol etílico de 96º.

Procedimiento.

1. Desinfectar con un algodón embebido de  alcohol el lóbulo de la oreja seleccionada para realizar la prueba.
2. Debemos dejar unos segundos para que se seque el alcohol.
3. Pinchamos con la lenceta el lóbulo de la oreja seleccionada y desechamos la primera gota.
4. Dejamos que salga sangre del lóbulo.
5. Recogemos con el papel de filtro la gota de sangre que este el lóbulo cada 30 segundos. 
6. Debemos cronometrar desde el momento que salga la primera gota de sangre hasta que deje de salir gotas de sangre del lóbulo.

Resultado.
El tiempo de hemorragia es 90 segundos.

Interpretación.
La persona esta sana.

Hoja de trabajo.

1º. ¿De quién es la técnica que se utiliza, en esta práctica, para determinar el tiempo de hemorragia?

Es la técnica de Duke.

2º. ¿ Cada cuánto tiempo se recoge la gota de sangre que está presente en el lóbulo de la oreja ?

Cada 30 segundos.

3º. ¿ Cuál es el tiempo de hemorragia normal?

Normalmente, la hemorragia se cohíbe espontáneamente en 1 a 3 minutos.

4º. ¿Qué fármaco aumenta, tras ser ingerido, el tiempo de hemorragia?

Ácido acetilsalicílico.

Resultado obtenido.

• Número de manchas de sangre que han quedado marcadas en el papel de filtro: 3 manchas.
• Tiempo transcurrido, desde que se ha puesto en marcha en cronómetro, hasta que se ha parado éste: 90 segundos.

Valoración de los resultados.

El tiempo de hemorragia obtenido:

Es normal.

Práctica XXV: P3 (27/02/2015)

PRUEBA SE LA SACAROSA.

Fundamento.
Esta prueba consiste en situar los hematíes en un medio de baja fuerza ionica en este caso solución sacarosa. Así los hematíes fijan los complementos y los hematíes presentes en la muestras que tienen una sensibilidad mas alta que el complemento se lisan.

Materiales.

1. Pipeta Pasteur.
2. Pipeta graduada ( una de 5 ml, dos de 2 ml y 3 de 0,5ml)
3. Micropipeta de 100 microlitro.
4. Puntas de micropipeta.
5. 6 tubos de centrifuga.
6. Un reloj.
7. Una centrifuga.
8. Un espectrofotómetro.
9. Cubetas de espectrofotómetro.
10. Rotulados de vidrio.
11. Una gradilla.

Reactivos.

1. Solución acuosa de sacarosa.
2. Sangre de la bolsa de sangre.
3. Suero fisiológico.

Muestra.

 Sangre venosa.

Procedimiento.

Primero debemos tomar tres tubos de centrifuga y los debemos rotular. Tenemos que usar las siglas SF de suero fisiológico  en el primer tubo ,otro tubo con la sigla SC de sangre control y el último tubo con al sigla SP de sangre problema.

Debemos rellenar estos tres tubos con :

1. Al primer tubo que seria el de suero fisiológico (SF) le añadimos con ayuda de una pipeta graduada 1,8 ml de suero fisiológico y con una micropipeta 0.2 ml de sangre problema.
2. Al tubo de sangre control (SC) le añadimos con una pipeta graduada 1,8 ml de solución sacarosa y con ayuda de una micropipeta 0,2 ml de sangre control.
3. Al tubo de sangre problema (SP) le añadimos con una pipeta graduada 1,8ml de solución de sacarosa y con una micropipeta 0,2 ml de sangre problema.

	Tubo SF	Tubo SC	Tubo SP
Suero fisiológico (en ml)	1,8
Solución sacarosa (en ml)		1,8	1,8
Sangre control (en ml)		0,2
Sangre problema (en ml)	0,2		0,2

Una vez que hayamos llenado los tubos los agitamos suavemente. Dejamos los tubos en reposo durante 30 minutos y por último lo centrifugamos durante 5 minutos a 2000rpm.
En el espectrofotómetro.

1. Primero tomar 3 tubos ( uno TB ( tubo blanco), TPr ( tubo problema), TPA (tubi patrón))
2. En el tubo TB se le añade 5 ml de solución acuosa de amoniaco y 0,3 ml de suero fisiológico.
3. En el tubo TPr se le añade 5 ml de solución acuosa de amoniaco y 0,3 del sobrenadante del tubo SP.
4. En el tubo TP se le añade 5 ml de solución acuosa de amoniaco y 0,2 de la mezla del tubo SF.
5. Pasar estas diluciones a tres cubetas.
6. Por último llevar al espectrofotómetro y obtener su absorbancia.

Resultado.

 % de hemólisis= (A/Am)x100
% de hemólisis =(0,007/0,438)x100 =1,60 % de hemólisis.

Am= 0,007
Ap= 0,438

A= Absorbancia del líquido presente en el tubo problema.

Am= Absorbancia del líquido contenido en el tubo patrón ( A máximo)

Hoja de trabajo.

1º. ¿Con qué solución se hemolizan los hematíes vertidos en el tubo problema?

Cloruro cálcico.

2º. ¿ A qué concentración se prepara la solución de sacarosa?

A una concentración del 9,24%

3º. ¿ Como se llama también la sacarosa?

Azúcar común.

4º. ¿ Qué es el ACD?

Ácido  cítrico - dextrosa.

5º. ¿ Cómo se prepara el tubo blanco?

El tubo blanco se prepara vertiendo 5 ml de solución aminiaco y 0,3ml de suero fisiológico.

6º. ¿Qué porcentaje de hemólisis suele producirse, con la prueba de la sacarosa, en la sangre de la HPN?

 Entre el 10 y 80 % de hemólisis.

Resultado obtenido.

Lectura espectrofotométrica.

Tubo	A	% de hemólisis
Patrón.	0,438	100 %
Problema.	0,007	1,60 %

Valoración de los resultados.

• Los hematíes problema: No tiene una sensibilidad aumentada al completo.
• El enfermo: no padece una HPN.

Práctica XXIV :P3 (27/02/2015)

ESTUDIO DE LA FRAGILIDAD OSMÓTICA DE LOS HEMATÍES.

Fundamento.
Esta practica valora la resistencia de los hematíes a soluciones de presión osmótica decreciente y para ello se enfrentan a cloruro sódico.

Materiales.

1. Dos pipetas Pasteur.
2. Ocho tubos de centrifuga que sean iguales.
3. Un reloj.
4. Una centrifuga.
5. Un espectrofotómetro.
6. Cubetas de espectrofotómetro.
7. Una gradilla.

Reactivo.

1. Suero fisiológico.
2. Agua destilada.

Muestra.

Sangre venosa.

Procedimiento.

Los primero que debemos de hacer es preparar 8 tubos de centrifuga que sean iguales entre sí.  Los ochos tubos deben estar perfectamente numerados, los cuatro primero se nombraran 1,2,3,4 y los otros cuatro se nombraran 15,16,17 y 18. 

A continuación añadimos a cada tubo 50 microlitros de sangre sin que toque la pared de los tubos.Después añadimos al tubo 1 18 gotas de suero fisiológico tamponado, al tubo 2 se le añade 1 gota de agua destilada y 17 gotas de suero fisiológico tamponado, al tubo 3 se le añade 2 gotas de agua destilada y 16 gotas de suero fisiológico, al tubo 4 se le añade 3 gotas de agua destilada y 15 gotas de suero fisiológico tamponado,  al tubo 15 se el añade 14 gotas de agua destilada y 4 gotas de suero fisiológico tamponado, al tubo 16 se le añade 15 gotas de agua destilada y 3 gotas de suero fisiológico  tamponado, al tubo 17 se le añade 16 gotas de agua destilada y 2 gotas de suero fisiológico tamponado y por último al tubo 18 se le añade 17 gotas de agua destilada y 1 gota se suero fisiológico tamponado.

Tubo nº	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18
Agua destilada (gotas)	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17
Suero fisiológico Tamponado (gotas)	18	17	16	15	14	13	12	11	10	9	8	7	6	5	4	3	2	1
Concentración obtenida (en g/l)	9	8,5	8	7,5	7	6,5	6	5,5	5	4,5	4	3,5	3	2,5	2	1,5	1	0,5

Agitamos suavemente los tubos hasta que se mezcle la sangre con la batería de cloruro sódico y lo dejamos reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Pasado este tiempo se centrifuga los 8 tubos durante 5 minutos a 2000 rpm.

Por último sacamos el sobrenadante y lo ponemos en las cubetas; estas cubetas las metemos en el espectrofotómetro y anotamos su absorbancia.

Resultado.

Tubo 1 ---> 0,248
Tubo 2 --->1,001
Tubo 3 ---->0,694
Tubo 4 --->0,532
Tubo 15 --->0,964
Tubo 16 --->1,021
Tubo 17 --->1,022
Tubo 18 --->1,060

% de hemólisis = (A/AM)X100
A = Absorbancia del líquido presente en el tubo analizado.
Am= Absorbancia del líquido contenido en el tubo nº 18 ( A máximo)

Tubo 1.

% de hemólisis =( 0,248/1,060)x100 = 23,39 %

Tubo 2.

% de hemólisis = (1,001/ 1,060) x 100= 94,43

Tubo 3.

% de hemólisis= (0,694/1,060) x100= 65,74%

Tubo 4.

% de hemólisis= (0,532/1,060) x100 = 50,18%

Tubo 15.

% de hemólisis= (0,964/1,060) x100 = 90,94%

Tubo 16.

% de hemólisis= (1,021/1,060) x100 = 96,32%

Tubo 17.

% de hemólisis=(1,022/1,060) x100 = 96,41%

Tubo 18.

% de hemólisis=(1,060/1,060) x100 = 100%

Hoja de trabajo.
1º. ¿ Qué concentración de NaCl tiene el suero fisiológico?
9 gramos de cloruro sódico.

2º ¿ En qué porcentaje se puede incrementar normalmente el volumen de los hematíes sin que éstos se rompan?
Se puede incrementar su volumen en un 70 % como máximo.

3º¿Qué sustancia se emplea para anticoagular la sangre en esta prueba?
cloruro sódico.

4º En esta prueba,¿cuál es la concentración salina menor a la que se preparan las soluciones?
9 g/l.

5º En condiciones normales,¿ a qué concentración salina suele producirse una hemólisis del 50%?
a 4,5 y 4 g/l.

6º ¿En qué enfermedades se produce una disminución de la ROE ?
En la esferocitosis hereditaria, estomacitosis hereditaria.

Resultados obtenido.
Lectura visual.

• Primer tubo en el que se observa con claridad una hemólisis parcial: 10

Concentración de la solución salina contenida en este tubo:4,5 g/l

• Primer tubo en el que se aprecia una hemólisis prácticamente total :14

Concentración de la solución salina presente en este tubo :2,5 g/l

Tubo nº	A	% de hemólisis.
1	0,248	23,39 %
2	1,001	94,43
3	0,694	65,74%
4	0,532	50,18%
5	No	No
6	No	No
7	No	No
8	No	No
9	No	No
10	No	No
11	No	No
12	No	No
13	No	No
14	No	No
15	0,964	90,94%
16	1,021	96,32%
17	1,022	96,41%
18	1,060	100%

• Concentración de la solución salina que da lugar  a una hemólisis del 50% : 4 g/l

Valoración de los resultados.

• La fragilidad osmótica  de los hematíes contenidos en la sangre estudiada es: Normal.
• La ROE de la sangre analizada es: normal.