Práctica LVI:P4 (23/04/2015)

DETERMINACIÓN CELULAR EN TUBO.

Fundamento.

Los hematíes de deben enfrentar a sueros conocidos que tengan anticuerpos frente a los antígenos. Por último tenemos que observar si hay aglutinación o no en los hematíes.

Materiales.

• Tubos de centrifuga
• Rotulador de vidrio
• Pipeta pasteur 
• Centrífuga
• Gradilla.

Reactivos.

• Suero anti-A
• suero anti-B
• Suero anti-AB
• Solución salina fisiológico.

Muestra.

Es preferible utilizar una suspensión de los hematíes problemas.

Procedimiento.

Lo primero que realizamos es el lavados de los hematíes.
Para ello depositamos 1 ml de sangre y lo completamos con solución salina, lo agitamos y lo centrifugamos a 200 rpm durante 4 minutos. Después desechamos el sobrenadante y volvemos a realizar el paso anterior 2 veces más. En la última centrifugación que realizamos desechamos el sobrenadante y preparamos hematíes al 2 %. En un tubo depositamos 2 gotas de los hematíes lavados y 5 ml de suero fisiológico lo agitamos y así obtenemos una suspensión al 2 %.
Rotulamos 3 tubos de ensayo con las letras A, B y AB, a cada uno de estos tres tubos le depositamos una gota de suspensión de hematíes al 2 %. Luego estos tres tubos que son pequeños lo metemos dentro de otros tubos un poco más grande y al tubo A le depositamos dos gotas del suero anti-A , al tubo B le depositamos  dos gotas de suero anti-B y al tubo AB le depositamos dos gotas de suero anti-AB y agitamos los tubos . Por último tapamos cada tubo con papel parafim y lo centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minuto y observamos si hay aglutinación. Si hay aglutinación significa que pertenece a ese grupo sanguíneo.

Hoja de trabajo.
1. ¿Qué tipo de técnica inmunológica se emplea en este análisis ?
Determinación celular en tubo.

2. ¿A qué concentración se prepara la suspensión de hematíes problemas ?
Al 2 %

3. ¿Cómo se ve una aglutinación positiva ?
Se observa un botón de hematíes que permanecen unidos una vez desprendido el sedimento.

4. ¿A qué se debe el fenómeno de Rouleaux?
Consiste en una agrupación no específica de hematíes, que adoptan una imagen de pila de monedas.

5.¿Cómo se pueden evitar los falsos positivos ?
Con el lavado previo de los hematíes problema.

Resultado obtenido.
Se observa aglutinación en el tubo A y en el tubo AB (tubo de control)

Valoración de los resultados obtenidos.
 La sangre ensayada es del grupo eritrocitario:
A

Práctica LV :P4 .(22/04/2015)

DETERMINACIÓN CELULAR EN PORTA.

Fundamento.

Consiste en observar si hay aglutinación de los hematíes cuando vertemos anticuerpos conocidos.

Materiales.

• Portaobjetos.
• Pipeta pasteur.
• Palillos.
• Rotulador de vidrio.
• Lanceta
• Capilar
• Gasas 

Reactivos.

• Alcohol.
• Suero anti-A
• Suero anti-B

Muestra.

• Sangre capilar.

Procedimiento.

Lo primero que hay que hacer es dividir el portaobjetos en dos partes, en el lado izquierdo marcamos con la letra A y en el derecho con la letra B. Con una lanceta pinchamos el pulpejo del dedo, previamente desinfectado con alcohol, y con un capilar tomamos la sangre. 

 Después depositamos  una gota de suero anti-A en la sección A del portaobjetos y una gota de suero anti-B  en la sección B del portaobjetos , y situar una pequeña gota de sangre junto a la gota de antisuero. Posteriormente mezclamos ambas gotas con un palillo distinto en cada parte del portaobjeto. 

Por último observamos la presencia o ausencia de aglutinación.

Resultado.

Resultado de la Mesa 1 .

Hoja de trabajo.

1. ¿ Qué tipo de técnica inmunológica se emplea en este análisis ?

 Técnica  de la determinación celular en porta.

2. ¿Qué muestra utilizamos ?

 Sangre capilar  o sangre total anticoagulada, citratada u oxalatada.

3. ¿ Cómo se ve la aglutinación positiva ?

Aparecen unos grumos rojos que flotan en un líquido claro.

4. ¿Qué debemos hacer si el grupo obtenido es A ?

Los hematies problema deberán ser ensayados de nuevo con lectina  anti -A1;de forma que si se produce aglutinación, el sujeto pertenecerá al grupo A1.

Resultado obtenido.

 Aglutinación en la sección del porta del grupo A.

Valoración de los resultados.

La sangre analizada es del grupo eritrocitario :

A

Como el grupo obtenido ha sido el A, los hematíes deben ser ensayados de nuevo con el lectina anti- A1. Lo que hay que hacer en dividir otro portaobjetos por la mitad y poner en el lado izquierdo A1 y en el lado derecho A2 . Después depositamos una gota de sangre en la sección A y a lado de la gota depositamos una gota de lactina anti-A1. Si hay aglutinación en el A1  significa que pertenece al grupo sanguíneo A1 y si no aglutina sera del grupo sanguíneo A2. En esta caso ha aglutinado en A1 por lo tanto es del grupo sanguíneo A1.

Grupo sanguíneo A1

Gráfica grupos sanguíneos.

Práctica XLI :P3 (9/03/2015).

DETERMINACIÓN FUNCIONAL DE FIBRINÓGENO.

Fundamento.
El fibrinógeno se transforma en fibrina en presencia de exceso de trombina. El tiempo de formación del coagulo en esta practica es inversamente proporcional a la concentración de fibrinógeno presente ne la muestra del plasma. En presencia de altas concentración de trombina el tiempo de formación del coágulo en el plasma es inversamente proporcional a la concentración de fibrinógeno.

Materiales.

1. Pipeta graduada.
2. Micropipeta.
3. Cubetas de coagulometro.
4. Coagulometro.
5. Gradilla.

Reactivos.

• R1 : Trombina Bovina.

• R2: Tampón imidazol.

• R3: Solución caolín.

• Coagulation Cal.

Muestra.

Plasma pobre en plaquetas.

Procedimiento.

• Dilución 1/10 con la muestra (PPP) y R2 ( tampón imidazol) .Sería 50 microlitros de muestra más 450 microlitros de R2.
• Tomamos 5 tubos y lo rotulamos según su concentración, que sería 1/40, 1/30.1/20,1/10,1/5.

En el tubo 1/40 se le añade 3,9 ml de R2 y 100  microlitros de coagulation.

En el tubo 1/30 se le añade 2,9 ml de R2 y 100 microlitros de coagulation.

En el tubo 1/20 se le añade 1,9 ml de R2 y 100 microlitros de coagulation.

En el tubo 1/10 se le añade 0,9 ml de R2 y 100 microlitros de coagulation.

En el tubo 1/5 se le añade 0,4 ml de R2 y 100 microlitros de coagulation.

•  Añadimos  200 microlitros de cada dilución en cubetas de coagulometro y se le añade 20 microlitros de R3 y lo atemperamos a 37º durante 4 minutos.
• Añadimos 100 microlitros de reactivo R1 y cronometrar la formación del coágulo.

Hoja de trabajo.

1º. ¿ De qué tipo es la determinación de fibrinógeno realizada en esta práctica?

Esta práctica se basa en la medición del tiempo que tarda un exceso de trombina en degradar a fibrina el fibrinógeno presente en un PPP diluido y, por tanto, en formar un coagulo.

2º. ¿A qué concentración está la trombina bovina?

A una concentración de 100 U NIH/ml.

3º. ¿A qué dilución se somete a la muestra?

A 1/10

4.º¿Cuál es la fibrinogenemia normal?
La fibrinogenemia normal oscila entre los 150 y los 450 mg/dl.

Resultados obtenidos.

Curva del fibrinogeno.

Dilución del plasma calibrador.	Concentración.	Tiempo en el que coagula.
1/40	0,25*xC	48,5
1/30	0,33*xC	37,4
1/20	0,5*xC	9,4
1/10	1*xC	142,7
1/5	2*xC	7

Tiempos obtenido en el coagulómetro.

Tiempo, en segundos, en el que coagula la muestra:

10 segundos.

Valoración de los resultados.

La fibrinogenemia es:
Normal.

Práctica XLV : P3. (10/3/20154)

PRUEBA DE MEZCLA CON PLASMA NORMAL.

Fundamento.

En esta práctica vamos a mezclar en cantidades iguales de pool de plasma y plasma pobre en plaquetas anormal, para determinar el tiempo de protrombina.

Materiales.

1. Gradilla,
2. Cubeta de coagulometro.
3. Trocitos de acero.
4. Un rotulador de vidrio.
5. Una coagulometro.
6. Un micropipeta de de 100 microlitros.
7. Una baño de agua.
8. Tubo de ensayo de plástico.

Reactivos.

• Solución de cloruro calcico 0,025 M
• Una cefalina activa con ácido elagico.
• Pool de plasma normales.

Muestra.

Plasma pobre en plaquetas.

Procedimiento.

1. Lo primero que hay que hacer es mezclar 100 microlitros de pool de plasma con 100 microlitros de plasma pobre en plaquetas anormal.

PPP anómalo.	100 uL
Pool de plasma normales o Plasma control normal.	100 uL
Dilución.	1/2

1. Lo incubamos en el baño de agua a 37ºC durante 60 minutos.
2. Tomamos 200 microlitros de cloruro calcico añadimos en un tubo de plastico y lo incubamos en el baño durante 5 minutos a 37 ºC.
3. Tomamos dos cubetas de coagulometro, le introducimos en trozo de acero y lo rotulamos como M1 y M2.
4. A las cubetas M1 Y M2 le añadimos 100 microlitros de la dilución anterior ( 100 microlitros de PPP anormal y 100 microlitros de pool de plasma) y también le añado 100 microlitros de cefalina.
5. En el coagulometro lo ponemos en la celda adecuada y le ponemos encima en tapón rojo y se le añade 100 microlitros de cloruro calcico después le pulso Reser y empieza a contar el tiempo que tarda en coagula; el mismo proceso se realiza para la cubeta M2.

Resultado.

M1: 60segundos.
M2:68 segundos.

Hoja de trabajo.

1.º ¿Cuándo debe hacerse una prueba de mezcla con plasma normal?

Se practica generalmente cuando en el plasma problema se determina un TP normal y un TTPA alargado. En estas circunstancias se supone que el paciente sufre un déficit de algún factor de la vía intrínseca y, en concreto , de los factores VII, IX,XI o XII.

2.º Si tras la mezcla con plasma normal, no se corrige el TTPA, ¿ qué se debe investigar?

Si el TTPA de la mezcla no se corrige con respecto al del PPP problema puro, el trastorno coagulatorio se debe a otros motivos como, por ejemplo , a la actuación de sustancias inhibidoras de la coagulación.

Resultados obtenidos.

Tras la mezcla del plasma problema anómalo con plasma normal:
Se ha corregido el TTPA.

Valoración de los resultados.

La prueba realizada indica:

La ausencia de algún factor de la vía intrínseca de la coagulación en el plasma anómalo.

Pruebas que investigan la coagulación. (2 /03/2015)

Tiempo de coagulación.

Fundamento.

Determinar el tiempo que tarda en coagularse la sangre en un capilar.

Materiales.

• Capilar sin heparina.
• Baño de agua.
• Lanceta.
• Algodón.

Reactivo.

Alcohol.

Muestra.

Sangre venosa sin anticoagulante.

Procedimiento.

1. Se sitúa la muestra dentro de un tubo de vidrio.
2. Se incuba a 37º C.
3. Se cuenta el tiempo trascurrido desde el deposito de la sangre en el tubo hasta la aparicion de un coagulo en el interior del tubo.
4. Los valores normales se sitúan entre los 5- 10 minutos.

Resultado.

Se tardo 3 minutos.

Esta prueba ya esta en desuso.

Práctica XXVI:P3 (2/03/2015)

DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR (VSG)

Fundamento.

La sangre se coloca en un tubo que esta dispuesto verticalmente, de este modo la sangre por acción de la gravedad se desplaza hacia el fondo del tubo. Este proceso normalmente es lento porque la acción con la que es atraído los hematíes es casi compensada por la fuerza ascendente creada por el plasma al desplazarse hacia arriba.

Materiales.

1. Pipeta de vidrio desechable que agrega en su interior una embolo de aspiración de plástico.
2. Una gradilla
3. Un tubo con citrato sódico con tapón de goma perforable.
4. Reloj.

Reactivos.

Citrato sódico 3,8 %

Muestra.

Sangre fresca.

Procedimiento.

Lo primero que debemos de hacer es llenar el tubo con citrato sódico con sangre fresca, después lo mezclamos agitando suavemente y por boca del tubo le introducimos la pipeta desechable que se debe llenar con la sangre hasta el algodón. Realizar la lectura a la primera hora y ala segunda hora.

Resultado.

• Sexo del paciente : Varón.

Primera hora = 5 mm

Segunda hora=10 mm

Valoración de los resultados.

Teniendo en cuenta el sexo del paciente, la VSG obtenida es:

Normal.

Hoja de trabajo.

1.º ¿Cómo se llama la carga electrostática negativa de los glóbulos rojos?

Potencia Z.

2.º ¿Qué anticoagulante es el más apropiado para realizar una determinación de la VSG?

Citrato sodico al 3,8 %

3.º ¿ A que temperatura se recomienda practicar la determinación de la VSG ?

A temperatura ambiente a unos 27º

4º. ¿Qué ocurre si la pipeta de VSG esta inclinada durante la determinación?

Que no bajara al mismo ritmo que si lo esta verticalmente bien.

5º. ¿En que circunstancia fisiologica aumenta la VSG?

En presencia de patología aumenta en la vejez y a partir del tercer mes de embarazo.

6º. ¿A que tiempos se efectúa la lectura del VSG?

A la primera y segundo hora.

Práctica XXXIX :P3 (4/03/2015) .

DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA (TTPA)

Fundamento.
Esta práctica se realiza introduciendo en un tubo PPP (plasma pobre plaquetas) y añadiendo cloruro cálcico utilizando el coagulómetro.
El sustituto del factor 3 plaquetario es un dilución fosfolipida creada con cerebros de conejo llama cefalina.

Material.

• Una gradilla.
• 2 cubetas.
• 2 trocitos de acero.
• Un rotulador.
• Micropipeta de 100 microlitros.
• 7 puntas de micropipeta.
• Un coagulómetro.
• 4 tubos de ensayo de plástico.

Reactivos.

• Cloruro cálcico.
• Cefalina activada.
• Pool de plasmas normales.

Muestra.

Un plasma pobre en plaquetas (PPP).

Procedimiento.

Lo primero que hacemos en centrifugar la sangre a 3000 rpm durante 10 minuto para obtener plasma pobre en plaquetas. Rotular dos cubetas, uno con la letra M ( de muestra) y otro con la letra C ( de control). Añadimos con una micropipeta 100 microlitros de muestra al tubo M y 100 microlitros de plasma control normal en el tubo C; también se le añade 100 microlitros de cefalina. En las dos cubetas le introducimos un trocito de acero y lo dejamos alentar en las celdas del coagulómetro 2 minutos. Por último en el coagulometro, se coloca la cubeta en la celda adecuada y se le añade 100 microlitros de cloruro cálcico para que el magnetoagitador se ponga en marcha y comience la lectura.

Hoja de trabajo.
1º. ¿De dónde se obtiene el sustituto de f3p?
De una suspensión de fosfolípidos, obtenida a partir de cerebros de conejo, que recibe el nombre de cefalina.

2º.¿Cómo se llama el sustituto del f3p?
Se llama cefalina.

3º.¿Qué activadores de los fatores de contacto se pueden utilizar?
Como activadores de los factores de contacto se pueden utilizar varias sustancias, entre las que cabe destacar : el caolín, el polvo de vidrio, el sílice, el celite y el ácido elágico.

4º. ¿Cuántos segundos debe superar el TTPA de la muestra al del control para ser considerado anormal?
Se considera anormal un TTPA de la muestra superior, en más de 8 segundos, al del control.

Resultado obtenido.
TTPA de la muestra:
116,6 segundos.

TTPA del control.
28,1 segundos.

Diferencia entre el TTPA de la muestra y el TTPA del control :
116-28,1 = 88,5 segundos.
Cociente entre el TTPA de la muestra y el TTPA del control:
116,6/28,1 =4,4 segundos.

Valoración de los resultados.
La muestra ensayada tiene un TTPA:
Alargado.