Práctica LXII: P4 (13/05/2015)

DETERMINACIÓN DE UN Du.

Fundamento.

Para poner de manifiesto al Du ( antígeno D débil ) debemos sensibilizar los hematíes problema con un suero que tiene anticuerpos anti-D y después enfrentarlo al suero de Coombs. 

Debemos realizar una prueba de Coombs indirecta.

Material.

• Tubos de hemólisis.
• Centrífuga.
• Pipeta Pasteur.
• Gradilla
• Baño de agua.
• Reloj.

Reactivos.

• Suero anti-D humano.
• Suero antiglobulina humana de conejo ( suero de Coomb) .
• Solución salina fisiólogica.

Muestra.

Suspensión de hematíes al 5%.

Para obtener la suspensión de hematíes lo primero que  realizamos es el lavados de los hematíes.

Para ello depositamos 1 ml de sangre y lo completamos con 3 ml de solución salina, lo agitamos y lo centrifugamos a 2000 rpm durante 4 minutos. Después desechamos el sobrenadante y volvemos a realizar el paso anterior 2 veces más. En la última centrifugación que realizamos desechamos el sobrenadante y preparamos hematíes al 5%. En un tubo depositamos 5 gotas (250 microlitros) de los hematíes lavados y 5 ml de suero fisiológico lo agitamos y así obtenemos una suspensión al 5 %.

Procedimiento.
En un tubo de hemólisis depositamos una gota de suero anti-D y un gota de suspensión de hematíes al 5%. Lo mezclamos suavemente y lo incubamos a 37ºC durante 30 minutos. Después de incubar lavamos los hematíes, para ellos completamos el tubo con 3 ml de suero fisiológico y lo centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minutos, después desechamos el sobrenadante y volvemos a realizar el paso anterior 2 veces más. En la última centrifugación que realizamos desechamos completamente la solución salina y añadimos sobre el sedimento una gota de suero de Coombs y lo mezclamos. Por último centrifugamos el tubo a 1000 rpm durante 1 minuto.

Para evitar falsos positivos debemos realizar una prueba de Coombs directa de los hematíes problemas. Para ello realizamos los siguientes pasos:

1. Depositar en un tubo de hemólisis 1 ml de suspensión de hematíes problema.
2. Lavar los eritrocitos. Añadimos el tubo con suero fisiológico y lo centrifugamos a 1000rpm durante 1 minuto. Después desechamos el sobrenadante y volver a realizar el paso anterior 2 veces más. En el último lavado desechamos el sobrenadante.
3. Resuspender el sedimento que queda después del ultimo lavado.
4. Añadir 2 gotas de suero antiglobulina.
5. Centrifugamos al mezcla a 3000 rpm durante 1 minuto.
6. Observar si hay o no aglutinación.

Hoja de trabajo.

1. ¿Qué contiene el suero de Coombs?

Suero antiglobulina humana.

2. ¿Qué se detecta con la prueba directa ?

Intentamos detectar anticuerpos incompletos que han sensibilizado a los hematíes in vivo. 

3. ¿Qué podemos detectar con la prueba indirecta?

Se busca anticuerpos incompletos libres en el suero, o poner de manifiesto la presencia de antígenos débiles en la membrana de los hematíes.

4.¿ Qué buscamos en la sangre del paciente?

La presencia del antígeno Du.

5.¿ Qué ocurre si el control es positivo?

Que es Rh positivo y para evitar falsos positivos se realiza la prueba de Coombs directa con los hematíes problema.

Resultado obtenido.

	Aglutinación.
Tubo 1	Si aglutinación

Valoración de los resultados.

La sangre es: Rh positivo

Práctica LXI: P4 (07/05/2015)

DETERMINACIÓN DEL FENOTIPO Y GENOTIPO DEL SISTEMA Rh.

Fundamento.

El objetivo de esta práctica es investigar el genotipo del sistema Rh mediante el  enfrentamiento de los hematíes problema con diferentes antisueros dirigidos contra los antígenos que forman el sistema Rh.

Material. 

• Tubos de hemólisis.
• Centrífuga.
• Rotulador de vidrio.
• Pipetas Pasteur.
• Gradilla.

Reactivos.

• Suero anti-D.
• Suero anti-E
• Suero anti-C
• Suero anti-e
• Suero anti-c
• Solución salina fisiológica.

Muestra.

Suspensión de hematíes lavados al 5 %.

Para obtener la suspensión de hematíes lo primero que  realizamos es el lavados de los hematíes.

Para ello depositamos 1 ml de sangre y lo completamos con 3 ml de solución salina, lo agitamos y lo centrifugamos a 2000 rpm durante 4 minutos. Después desechamos el sobrenadante y volvemos a realizar el paso anterior 2 veces más. En la última centrifugación que realizamos desechamos el sobrenadante y preparamos hematíes al 5%. En un tubo depositamos 5 gotas (250 microlitros) de los hematíes lavados y 5 ml de suero fisiológico lo agitamos y así obtenemos una suspensión al 5 %.

Procedimiento.
Lo primero es rotular cinco tubos, cada uno con la letra D, C, E ,c y e. En cada tubos añadimos una gota del antisuero correspondiente  y una gota de la suspensión de hamatíes a 5%. Lo mezclamos suavemente. y por último centrifugamos todos los tubos a 1000 rpm durante 1 minuto.

Hoja de trabajo.

1.¿ Qué antisueros se utilizan en esta técnica ?

• Suero anti-D.
• Suero anti-E
• Suero anti-C
• Suero anti-e
• Suero anti-c

2.¿Por qué no existe suero anti-d ?

Porque no existe el antígeno d.

3.¿Qué expresan los cinco resultados obtenidos?

Los cinco resultados obtenidos expresan el fenotipo de la sangre analizada.

4. Si la sangre es Rh + , ¿puede determinarse exactamente su genotipo con respecto al sistema Rh?

No, si la sangre es Rh positivo (D+) existen varios genotipos posibles que dan lugar al fenotipo previamente detectado.

5.Si los resultados obtenidos son: D-, C-, E+, c+ y e- ; ¿ cuál es el genotipo posible de esta sangre?

Según nomenclatura de Fisher- Race los genotipos posibles son: dcE / dcE

Resultado obtenido.

Tubo	Aglutinación
D	-
C	+
E	+
c	+
e	no.

Valoración de los resultados.

El/los genotipo/s posible/s del sistema Rh en la sangre analizada es/son: dCe / dcE y  dCE/ dce

Práctica LX: P4 (5/05/2015)

DETERMINACIÓN DEL GRUPO Rh EN TUBO.

Fundamento.

El objetivo es la detección  del antígeno D en la superficie de los hematíes enfrentándolo a un suero anti-D.

Materiales.

• Tubos de hemólisis.
• Rotulador de vidrio.
• Gradilla.
• Pipeta Pasteur.
• Centrífuga.

Reactivos.

• Suero anti-D.
• Albúmina bovina al 30%
• Solución salina fisiológica.

Muestra.

Suspensión de hematíes al 5%.

Para obtener la suspensión de hematíes lo primero que  realizamos es el lavados de los hematíes.

Para ello depositamos 1 ml de sangre y lo completamos con 3 ml de solución salina, lo agitamos y lo centrifugamos a 2000 rpm durante 4 minutos. Después desechamos el sobrenadante y volvemos a realizar el paso anterior 2 veces más. En la última centrifugación que realizamos desechamos el sobrenadante y preparamos hematíes al 5%. En un tubo depositamos 5 gotas (250 microlitros) de los hematíes lavados y 5 ml de suero fisiológico lo agitamos y así obtenemos una suspensión al 5 %.
 Procedimiento.
Primero rotulamos dos tubos, una con la letra D y otro con la letra A. El en tubo D le depositamos una gota de suero anti-Dy en el tubo A le depositamos una gota de albumina bovina al 30% y agitamos. A los dos tubos le depositamos una gota de la suspensión de hematíes al 5%3 y agitamos los tubos. Por último centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minuto.

Hoja de trabajo.
1. ¿Por qué utilizamos el control de albúmina?
Porque si aparece aglutinación en ese tubo se debe repetir la prueba pero usando un suero anti-D en medio salino. El tubo con albúmina debe dar siempre negativo.

2.¿ Que ocurre si no aparece aglutinación en el tubo D ?
Si no produce aglutinación en ninguno de los dos tubos procedemos a incubar ambos a 37ºC durante media hora. Posteriormente centrifugamos a 1000 rpm durante un minuto y observamos si existe o no aglutinación. En el caso de persistir la negatividad comprobaremos que le paciente no posee un Du ( D débil) mediante una prueba de Cooms indirecta.

3. ¿Que debemos detectar mediante un Coombs indirecto ?
La presencia de un Du (D débil )

4. ¿Cómo se prepara la muestra problema?

Para obtener la suspensión de hematíes lo primero que  realizamos es el lavados de los hematíes.

Para ello depositamos 1 ml de sangre y lo completamos con 3 ml de solución salina, lo agitamos y lo centrifugamos a 2000 rpm durante 4 minutos. Después desechamos el sobrenadante y volvemos a realizar el paso anterior 2 veces más. En la última centrifugación que realizamos desechamos el sobrenadante y preparamos hematíes al 5%. En un tubo depositamos 5 gotas (250 microlitros) de los hematíes lavados y 5 ml de suero fisiológico lo agitamos y así obtenemos una suspensión al 5 %.

Resultado obtenido.

	Aglutinación.
Sección D	Aglutinación
Sección A	No aglutina.

Valoración de los resultados.

La sangre analizada es:

Rh positivo

Práctica LIX: P4 (5/05/2015).

DETERMINACIÓN DEL GRUPO Rh EN PORTA.

Fundamento.
La finalidad de esta práctica es la detección del antígeno D en la superficie de los hematíes problema empleando anticuerpos Anti-D. En el caso de contener el antígeno D se observara aglutinación.

Materiales.

• Portaobjetos.
• Pipeta pasteur.
• Rotulador de vidrio.
• Palillos.
• Visualizador luminoso.

Reactivos.

• Suero anti-D
• Albúmina bovina al 30 %.

Muestra.

 Sangre anticoagulada.

Procedimiento.

Lo primero que hay que hacer es dividir el portaobjetos en dos partes, en el lado izquierdo marcamos con la letra S (suero ) y en el derecho con la letra A (albúmina ). Con una lanceta pinchamos el pulpejo del dedo, previamente desinfectado con alcohol, y con un capilar tomamos la sangre.

Depositamos una gota de suero anti-D en el lado izquierdo marcado con la  letra S (suero) y en el lado derecho marcado con la letra A (albúmina) depositamos una gota de albúmina bovina al 30 %.

En los dos lados del portaobjeto, a lado de la gota de suero anti-D y la albúmina depositamos una gota de sangre y con palillos distintos mezclamos ambas partes. Por últimos colocamos el portaobjeto en el visualizador luminoso que favorece la mezcla de sangre y reactivo y observamos si hay aglutinación.

Hoja de trabajo.

1. ¿Qué tipo de muestra empleamos en esta técnica?

Determinación del grupo Rh en porta.

2. ¿Para qué se utiliza el visualizador ?

Para favorecer la mezcla de sangre y reactivos y también para observar mejor el resultado de la reacción

3. ¿Qué puede dar lugar a falsos aglutinaciones?
Aparición de pequeños coágulos de fibrina.

4. ¿Qué ocurre si aglutina la sección A ?
No podemos informar del resultado de la prueba.

Resultado obtenido.

	Aglutinación.
Sección S	+
Sección A	-

Resultado Mesa 1

Valoración de los resultados.

La sangre analizada es : Rh positivo.

Gráfica.

Práctica LVII :P4 (27/04/2015)

DETERMINACIÓN SÉRICA DEL GRUPO AB0

Fundamento.
Cuando hacemos reaccionar el suero del paciente con hematíes conocidos del grupo A y del B, solo habrá aglutinación en el caso de ser enfrentado a hematíes con antígeno diferente a los hematíes propios del paciente. En esta práctica hemos utilizado plasma en lugar de suero.

Materiales.

• Tubos de centrifuga.
• Pipeta pasteur.
• Centrifuga.
• Reloj.
• Rotulador de vidrio.
• Vaso de precipitado.
• Gradilla.

Reactivos.

• Hematíes del grupo A1.
• Hematíes del grupo A2.
• Hematíes del grupoB.
• Hematíes del grupo 0.
• Hematíes de la sangre problema.

Muestra.

Plasma, obtenido centrifugando la sangre a 2500 durante 5 minutos.

Procedimiento.

Lo primero que realizamos es el lavados de los hematíes.

Para ello depositamos 1 ml de sangre y lo completamos con 3 ml de solución salina, lo agitamos y lo centrifugamos a 2000 rpm durante 4 minutos. Después desechamos el sobrenadante y volvemos a realizar el paso anterior 2 veces más. En la última centrifugación que realizamos desechamos el sobrenadante y preparamos hematíes al 5%. En un tubo depositamos 5 gotas (250 microlitros) de los hematíes lavados y 5 ml de suero fisiológico lo agitamos y así obtenemos una suspensión al 5 %.

Esta suspensión de hematíes al 5 % lo tenemos que hacer con sangre del grupo sanguíneo A1,A2, B y 0.

Para evitar falsos negativos, mantenemos el plasma en el baño de agua a 56 ºC durante 10 minutos, con ello inactivamos la muestra y evitamos fenómenos de hemólisis debido al complemento.

Después rotulamos 5 tubos de hemólisis, uno con la letra A1, otro con la letra A2, otro con B , otro con 0 , otro con C y para compensar la centrifuga rotulamos otro tubo repitiendo alguna de las letras.

 A estos 6 tubos le depositamos dos gotas de plasma problema y depositamos una gota de suspensión de hematíes que se corresponda con la letra rotulada en cada tubo y en el tubo C le añadimos suspensión de hematíes propio de la sangre problema y nos servirá de control. Agitamos los 6 tubos y lo centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minuto. Por último observamos si hay aglutinación.

Hoja de trabajo.

1.¿ Qué son los hematíes tipados?

Hematíes de grupo sanguíneo conocido.

2.¿A qué dilución empleamos los hematíes del paciente ?

Al 5%

3.¿Qué clase de muestra se emplea en esta técnica?

Suero o plasma.

4.¿Qué ocurre cuando el tubo C presenta aglutinación?

Que el grupo eritrocitario es ininterpretable y presenta autoanticuerpos.

Resultado obtenido.

	Aglutinación	No aglutinación.
Tubo A1		No aglutina
Tubo A2		No aglutina
Tubo B	Si aglutina
Tubo 0		No aglutina
Tubo C		No aglutina

Valoración de los resultados.

• Los A encontrados en el suero son: anti-B
• El grupo eritrocitario de la sangre analizada es: A1

La primera vez que la hicimos no salio nada porque la concentración de suero fisiológico estaba mal hecho. Pero los resultados que he puesto me salieron al repetir cuando repetí la práctica.

Práctica LVI:P4 (23/04/2015)

DETERMINACIÓN CELULAR EN TUBO.

Fundamento.

Los hematíes de deben enfrentar a sueros conocidos que tengan anticuerpos frente a los antígenos. Por último tenemos que observar si hay aglutinación o no en los hematíes.

Materiales.

• Tubos de centrifuga
• Rotulador de vidrio
• Pipeta pasteur 
• Centrífuga
• Gradilla.

Reactivos.

• Suero anti-A
• suero anti-B
• Suero anti-AB
• Solución salina fisiológico.

Muestra.

Es preferible utilizar una suspensión de los hematíes problemas.

Procedimiento.

Lo primero que realizamos es el lavados de los hematíes.
Para ello depositamos 1 ml de sangre y lo completamos con solución salina, lo agitamos y lo centrifugamos a 200 rpm durante 4 minutos. Después desechamos el sobrenadante y volvemos a realizar el paso anterior 2 veces más. En la última centrifugación que realizamos desechamos el sobrenadante y preparamos hematíes al 2 %. En un tubo depositamos 2 gotas de los hematíes lavados y 5 ml de suero fisiológico lo agitamos y así obtenemos una suspensión al 2 %.
Rotulamos 3 tubos de ensayo con las letras A, B y AB, a cada uno de estos tres tubos le depositamos una gota de suspensión de hematíes al 2 %. Luego estos tres tubos que son pequeños lo metemos dentro de otros tubos un poco más grande y al tubo A le depositamos dos gotas del suero anti-A , al tubo B le depositamos  dos gotas de suero anti-B y al tubo AB le depositamos dos gotas de suero anti-AB y agitamos los tubos . Por último tapamos cada tubo con papel parafim y lo centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minuto y observamos si hay aglutinación. Si hay aglutinación significa que pertenece a ese grupo sanguíneo.

Hoja de trabajo.
1. ¿Qué tipo de técnica inmunológica se emplea en este análisis ?
Determinación celular en tubo.

2. ¿A qué concentración se prepara la suspensión de hematíes problemas ?
Al 2 %

3. ¿Cómo se ve una aglutinación positiva ?
Se observa un botón de hematíes que permanecen unidos una vez desprendido el sedimento.

4. ¿A qué se debe el fenómeno de Rouleaux?
Consiste en una agrupación no específica de hematíes, que adoptan una imagen de pila de monedas.

5.¿Cómo se pueden evitar los falsos positivos ?
Con el lavado previo de los hematíes problema.

Resultado obtenido.
Se observa aglutinación en el tubo A y en el tubo AB (tubo de control)

Valoración de los resultados obtenidos.
 La sangre ensayada es del grupo eritrocitario:
A

Práctica LV :P4 .(22/04/2015)

DETERMINACIÓN CELULAR EN PORTA.

Fundamento.

Consiste en observar si hay aglutinación de los hematíes cuando vertemos anticuerpos conocidos.

Materiales.

• Portaobjetos.
• Pipeta pasteur.
• Palillos.
• Rotulador de vidrio.
• Lanceta
• Capilar
• Gasas 

Reactivos.

• Alcohol.
• Suero anti-A
• Suero anti-B

Muestra.

• Sangre capilar.

Procedimiento.

Lo primero que hay que hacer es dividir el portaobjetos en dos partes, en el lado izquierdo marcamos con la letra A y en el derecho con la letra B. Con una lanceta pinchamos el pulpejo del dedo, previamente desinfectado con alcohol, y con un capilar tomamos la sangre. 

 Después depositamos  una gota de suero anti-A en la sección A del portaobjetos y una gota de suero anti-B  en la sección B del portaobjetos , y situar una pequeña gota de sangre junto a la gota de antisuero. Posteriormente mezclamos ambas gotas con un palillo distinto en cada parte del portaobjeto. 

Por último observamos la presencia o ausencia de aglutinación.

Resultado.

Resultado de la Mesa 1 .

Hoja de trabajo.

1. ¿ Qué tipo de técnica inmunológica se emplea en este análisis ?

 Técnica  de la determinación celular en porta.

2. ¿Qué muestra utilizamos ?

 Sangre capilar  o sangre total anticoagulada, citratada u oxalatada.

3. ¿ Cómo se ve la aglutinación positiva ?

Aparecen unos grumos rojos que flotan en un líquido claro.

4. ¿Qué debemos hacer si el grupo obtenido es A ?

Los hematies problema deberán ser ensayados de nuevo con lectina  anti -A1;de forma que si se produce aglutinación, el sujeto pertenecerá al grupo A1.

Resultado obtenido.

 Aglutinación en la sección del porta del grupo A.

Valoración de los resultados.

La sangre analizada es del grupo eritrocitario :

A

Como el grupo obtenido ha sido el A, los hematíes deben ser ensayados de nuevo con el lectina anti- A1. Lo que hay que hacer en dividir otro portaobjetos por la mitad y poner en el lado izquierdo A1 y en el lado derecho A2 . Después depositamos una gota de sangre en la sección A y a lado de la gota depositamos una gota de lactina anti-A1. Si hay aglutinación en el A1  significa que pertenece al grupo sanguíneo A1 y si no aglutina sera del grupo sanguíneo A2. En esta caso ha aglutinado en A1 por lo tanto es del grupo sanguíneo A1.

Grupo sanguíneo A1

Gráfica grupos sanguíneos.