Reacción en cadena de la polimerasa (13/05/2015)

PCR.

Fundamento.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que se basa en la replicación de ADN.

Con ello se consigue multiplicar exponencial mente un fragmento de ADN, consiguiendo una gran cantidad de copias de dicho fragmento. Se utiliza ADN polimerasa que puede actuar en altas temperaturas , a unos 95º C, la necesaria para la desnaturalizar el ADN y poder separar las cadenas. La polimerasa más usada es la Taq polimerasa, procedente de la bacteria Thermus acquaticus.

Materiales.

• Gradilla.
• Vaso de precipitado.
• Tubos esppendorf.
• Micropipeta 50 microlitros.
• Centrifuga
• Pipeta graduada de 5 ml y otra de 2 ml 

Reactivos.

• Suero salino.
• Matriz instagene

Muestra.

• Células mucosa de la boca.

Procedimiento.

1. En un tubo de ensayo le añadimos con un pipeta 3 ml de solución salina.
2. Después con un bastoncillo cojo la muestra de la boca y el bastoncillo lo deposito en el tubo de ensayo con la solución salina y lo dejo durante un minuto.
3. Saco el bastoncillo y deposito 1,4 ml de la mezcla anterior en un sppendorf  y lo centrifugo en la centrifuga para sppendorf a 8000 rpm durante 5 minutos.
4. Decantar el sobrenadante con cuidado.
5. Añadimos 70 microlitros de matriz instagene y lo resuspendemos con la micropipeta.
6. Lo incubamos durante 10 minutos a 100 ºC y después lo dejamos durante unos minutos a temperatura ambiente .
7. Centrifugamos la muestra  a 1300 rpm durante 30 segundos.
8. Pasamos 10 microlitros del sobrenadante a un microtubo lo rotulamos y lo congelamos.
9. En un tubo sppendorf le depositamos 18,5 microlitros de agua destilada  + 2 microlitros de oligo 1 + 2 microlitros de oligo 2 + 2,5 microlitros de ADN y le damos un golpe de centrifuga 
10. Tenemos que preparar un gel de agarosa y la electroforesis.
11. El gel lo preparamos de la siguiente forma : primero cojo un reloj de vidrio y se pesa 0,45 g  de agarosa y en un probeta ponemos unos 20 ml de agua destilada y se hecha la agarosa y enrasamos hasta los 30 ml y lo pasamos a un vaso de precipitado. Lo metemos en el microondas hasta que se disuelva completamente, no debe quedar ningún grupo, por último lo dejamos enfriar a 50 ºC. Al gel de agarosa le añadimos 1,5  microlitros de colorante  (Redsafe nucleic acid stainig solution)
12. Cuando ya hemos terminado el gel lo pasamos a la cubeta de la electroforesis que ya esta previamente sellada, después le ponemos los peines en la parte del cátodo negativo y otro peine en el medio. Cuando la gelatina ya este fija le quitamos los peines y así los pocillos se quedan marcados 
13. Los pocillos que están en los extremos son los controles, que lo llenamos con tampón de carga con azul de  metileno ( 5 microlitro de tampón de control + sacarosa+agua ) y los pocillo que están en el centro  los de arriba se llenan con tampón de carga  ( depositamos en una probeta 900 microlitros de glicerina mas 25 mg de azul de metileno y lo ensaramos hasta 10 ml con agua destilada) y la parte inferior con Tampón tae ( 100 microlitros deTAE mas 900 microlitros de agua destilada ).

Práctia LXIV: P4 (28/05/2015)

PRUEBA CRUZADA MAYOR.

Fundamento.

Esta práctica consiste en enfrentar suero del paciente con los  hematíes del donante ,para poder saber si son compatibles para una transfusión. Primero se realiza en un medio salino, después en un medio albuminosos y por último lo enfrentamos al suero de Coombs.

Materiales.

• Tubo de hemólisis.
• Centrífuga.
• Baño de agua.
• Pipetas Pasteur.
• Gradilla .
• Reloj.

Muestra.

• Plasma del receptor.
• Suspensión de hematíes del donante al 5%.

Para obtener la suspensión de hematíes lo primero que  realizamos es el lavados de los hematíes.

Para ello depositamos 1 ml de sangre y lo completamos con 3 ml de solución salina, lo agitamos y lo centrifugamos a 2000 rpm durante 4 minutos. Después desechamos el sobrenadante y volvemos a realizar el paso anterior 2 veces más. En la última centrifugación que realizamos desechamos el sobrenadante y preparamos hematíes al 5%. En un tubo depositamos 5 gotas (250 microlitros) de los hematíes lavados y 5 ml de suero fisiológico lo agitamos y así obtenemos una suspensión al 5 %.

Reactivos.

• Solución salina fisiológica.
• Albumina bovina al 30%
• Suero de Coombs.

Procedimiento.

1. Depositamos en un tubo de hemólisis una gota de suspensión de  hematíes del donante y dos gotas de plasma del receptor. Lo mezclamos y lo dejamos reposar durante 2 minutos.
2. Centrifugamos a 3000 rpm durante 1 minuto.
3. Leemos el resultado, es decir observamos si hay aglutinación en el caso de que se observemos un botón hemático no debemos seguir con la práctica ya que indica que son incompatibles.Pero si no observamos el botón hay que seguir. ( Cuando realice la práctica se observo el botón hemático por lo que no tuvimos que realizar los pasos siguientes )
4. Añadimos al tubo 3 gotas de albúmina, lo mezclamos y lo incubamos a 37ºC durante 30 minutos.
5. Centrifugamos a 3000 rpm durante 1 minutos y observamos si hay aglutinación, si no se observa el botón hemático debemos seguir la práctica.
6. Lavamos los hematíes con suero fisiológico tres veces.
7. En el último lavamos desechamos correctamente el sobrenadante y depositamos una gota de suero de Coombs y mezclamos bien.
8. Centrifugamos a 1000 rpm durante 2 minutos, y por último leemos los resultados.
9. Si se observa el botón hemático indica incompatibilidad y si no hay aglutinación en ninguno de los pasos indica que son compatibles.

Hoja de trabajo.

1. ¿Qué se enfrenta en la prueba cruzada mayor?

Se enfrenta el suero del receptor con los hematíes del donante.

2.¿ Cuándo se debe realizar la prueba cruzada menor?

Sólo se realiza cuando se transfunde una gran cantidad de plasma, ya que en este caso, la presencia de anticuerpos en la sangre del donante puede ser peligroso.

3. ¿Por qué debemos realizar la prueba en medio salino y albuminoso?

Para detectar todos los anticuerpos presentes.

4.¿ Qué pone de manifiesto el suero antiglobulina  de Coombs ?

Los anticuerpos que se hayan quedado fijados a la membrana eritrocitaria.

Resultado.

	Resultado.
Medio salino.	Se observa el botón hematico.
Medio albuminoso	No se ha realizado
Suero antiglobulina	No se ha realizado

Valoración de los resultados.

Las sangres analizadas son:

Incompatibles.

Práctica LIV: P2 (22/05/2015)

DETERMINACIÓN RÁPIDA DE HEMOGLOBINA.

Fundamento.

El objetivo de esta práctica es determinar la concentración de hemoglobina antes de una donación. 

Para poder donar, la sangre del donante tiene que ser más densa que una solución de sulfato de cobre y caer libremente a través de ella.

Materiales.

• Lanceta
• Gasas
• Vaso de precipitado.

Reactivo.

• Alcohol.
• Solución de sulfato de cobre a una densidad de 1,052 g/dl.

Para hacer sulfato de cobre debemos disolver 17 g de sulfato de cobre en 100 ml de agua destilada, lo añadimos en un matraz aforado de 100 ml y después de haberlo enrasado le añadimos 0,74 ml de agua destilada para obtener la misma densidad a una temperatura ambiente de 22ºC. Por último mezclar 51 ml de la solución de sulfato de cobre (solución madre) con 49 ml de agua destilada.

Muestra.

Sangre capilar.

Procedimiento.

1. Añadimos la solución de sulfato de cobre en un vaso de precipitado de 50 ml.
2. Con una lanceta pinchar en el pulpejo del dedo.
3. Dejamos caer una gota de sangre con algo de impulso sobre la solución de sulfato de cobre.

Hoja de trabajo.

1. ¿Cuál es el valor mínimo de hemoglobina que debe tener una mujer antes de la donación ?

12,5 g/dl.

2.¿ Con qué otra solución comparamos la densidad de la sangre?

Con una solución de sulfato de cobre  a una densidad de 1,050g/dl

Resultado.

 La gota de sangre ha caído libremente a través de la solución de sulfato de cobre.

Valoración de los resultados.

El donante es pato : Si.

Práctica LXII: P4 (13/05/2015)

DETERMINACIÓN DE UN Du.

Fundamento.

Para poner de manifiesto al Du ( antígeno D débil ) debemos sensibilizar los hematíes problema con un suero que tiene anticuerpos anti-D y después enfrentarlo al suero de Coombs. 

Debemos realizar una prueba de Coombs indirecta.

Material.

• Tubos de hemólisis.
• Centrífuga.
• Pipeta Pasteur.
• Gradilla
• Baño de agua.
• Reloj.

Reactivos.

• Suero anti-D humano.
• Suero antiglobulina humana de conejo ( suero de Coomb) .
• Solución salina fisiólogica.

Muestra.

Suspensión de hematíes al 5%.

Para obtener la suspensión de hematíes lo primero que  realizamos es el lavados de los hematíes.

Para ello depositamos 1 ml de sangre y lo completamos con 3 ml de solución salina, lo agitamos y lo centrifugamos a 2000 rpm durante 4 minutos. Después desechamos el sobrenadante y volvemos a realizar el paso anterior 2 veces más. En la última centrifugación que realizamos desechamos el sobrenadante y preparamos hematíes al 5%. En un tubo depositamos 5 gotas (250 microlitros) de los hematíes lavados y 5 ml de suero fisiológico lo agitamos y así obtenemos una suspensión al 5 %.

Procedimiento.
En un tubo de hemólisis depositamos una gota de suero anti-D y un gota de suspensión de hematíes al 5%. Lo mezclamos suavemente y lo incubamos a 37ºC durante 30 minutos. Después de incubar lavamos los hematíes, para ellos completamos el tubo con 3 ml de suero fisiológico y lo centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minutos, después desechamos el sobrenadante y volvemos a realizar el paso anterior 2 veces más. En la última centrifugación que realizamos desechamos completamente la solución salina y añadimos sobre el sedimento una gota de suero de Coombs y lo mezclamos. Por último centrifugamos el tubo a 1000 rpm durante 1 minuto.

Para evitar falsos positivos debemos realizar una prueba de Coombs directa de los hematíes problemas. Para ello realizamos los siguientes pasos:

1. Depositar en un tubo de hemólisis 1 ml de suspensión de hematíes problema.
2. Lavar los eritrocitos. Añadimos el tubo con suero fisiológico y lo centrifugamos a 1000rpm durante 1 minuto. Después desechamos el sobrenadante y volver a realizar el paso anterior 2 veces más. En el último lavado desechamos el sobrenadante.
3. Resuspender el sedimento que queda después del ultimo lavado.
4. Añadir 2 gotas de suero antiglobulina.
5. Centrifugamos al mezcla a 3000 rpm durante 1 minuto.
6. Observar si hay o no aglutinación.

Hoja de trabajo.

1. ¿Qué contiene el suero de Coombs?

Suero antiglobulina humana.

2. ¿Qué se detecta con la prueba directa ?

Intentamos detectar anticuerpos incompletos que han sensibilizado a los hematíes in vivo. 

3. ¿Qué podemos detectar con la prueba indirecta?

Se busca anticuerpos incompletos libres en el suero, o poner de manifiesto la presencia de antígenos débiles en la membrana de los hematíes.

4.¿ Qué buscamos en la sangre del paciente?

La presencia del antígeno Du.

5.¿ Qué ocurre si el control es positivo?

Que es Rh positivo y para evitar falsos positivos se realiza la prueba de Coombs directa con los hematíes problema.

Resultado obtenido.

	Aglutinación.
Tubo 1	Si aglutinación

Valoración de los resultados.

La sangre es: Rh positivo

Práctica LXI: P4 (07/05/2015)

DETERMINACIÓN DEL FENOTIPO Y GENOTIPO DEL SISTEMA Rh.

Fundamento.

El objetivo de esta práctica es investigar el genotipo del sistema Rh mediante el  enfrentamiento de los hematíes problema con diferentes antisueros dirigidos contra los antígenos que forman el sistema Rh.

Material. 

• Tubos de hemólisis.
• Centrífuga.
• Rotulador de vidrio.
• Pipetas Pasteur.
• Gradilla.

Reactivos.

• Suero anti-D.
• Suero anti-E
• Suero anti-C
• Suero anti-e
• Suero anti-c
• Solución salina fisiológica.

Muestra.

Suspensión de hematíes lavados al 5 %.

Para obtener la suspensión de hematíes lo primero que  realizamos es el lavados de los hematíes.

Para ello depositamos 1 ml de sangre y lo completamos con 3 ml de solución salina, lo agitamos y lo centrifugamos a 2000 rpm durante 4 minutos. Después desechamos el sobrenadante y volvemos a realizar el paso anterior 2 veces más. En la última centrifugación que realizamos desechamos el sobrenadante y preparamos hematíes al 5%. En un tubo depositamos 5 gotas (250 microlitros) de los hematíes lavados y 5 ml de suero fisiológico lo agitamos y así obtenemos una suspensión al 5 %.

Procedimiento.
Lo primero es rotular cinco tubos, cada uno con la letra D, C, E ,c y e. En cada tubos añadimos una gota del antisuero correspondiente  y una gota de la suspensión de hamatíes a 5%. Lo mezclamos suavemente. y por último centrifugamos todos los tubos a 1000 rpm durante 1 minuto.

Hoja de trabajo.

1.¿ Qué antisueros se utilizan en esta técnica ?

• Suero anti-D.
• Suero anti-E
• Suero anti-C
• Suero anti-e
• Suero anti-c

2.¿Por qué no existe suero anti-d ?

Porque no existe el antígeno d.

3.¿Qué expresan los cinco resultados obtenidos?

Los cinco resultados obtenidos expresan el fenotipo de la sangre analizada.

4. Si la sangre es Rh + , ¿puede determinarse exactamente su genotipo con respecto al sistema Rh?

No, si la sangre es Rh positivo (D+) existen varios genotipos posibles que dan lugar al fenotipo previamente detectado.

5.Si los resultados obtenidos son: D-, C-, E+, c+ y e- ; ¿ cuál es el genotipo posible de esta sangre?

Según nomenclatura de Fisher- Race los genotipos posibles son: dcE / dcE

Resultado obtenido.

Tubo	Aglutinación
D	-
C	+
E	+
c	+
e	no.

Valoración de los resultados.

El/los genotipo/s posible/s del sistema Rh en la sangre analizada es/son: dCe / dcE y  dCE/ dce

Práctica LX: P4 (5/05/2015)

DETERMINACIÓN DEL GRUPO Rh EN TUBO.

Fundamento.

El objetivo es la detección  del antígeno D en la superficie de los hematíes enfrentándolo a un suero anti-D.

Materiales.

• Tubos de hemólisis.
• Rotulador de vidrio.
• Gradilla.
• Pipeta Pasteur.
• Centrífuga.

Reactivos.

• Suero anti-D.
• Albúmina bovina al 30%
• Solución salina fisiológica.

Muestra.

Suspensión de hematíes al 5%.

Para obtener la suspensión de hematíes lo primero que  realizamos es el lavados de los hematíes.

Para ello depositamos 1 ml de sangre y lo completamos con 3 ml de solución salina, lo agitamos y lo centrifugamos a 2000 rpm durante 4 minutos. Después desechamos el sobrenadante y volvemos a realizar el paso anterior 2 veces más. En la última centrifugación que realizamos desechamos el sobrenadante y preparamos hematíes al 5%. En un tubo depositamos 5 gotas (250 microlitros) de los hematíes lavados y 5 ml de suero fisiológico lo agitamos y así obtenemos una suspensión al 5 %.
 Procedimiento.
Primero rotulamos dos tubos, una con la letra D y otro con la letra A. El en tubo D le depositamos una gota de suero anti-Dy en el tubo A le depositamos una gota de albumina bovina al 30% y agitamos. A los dos tubos le depositamos una gota de la suspensión de hematíes al 5%3 y agitamos los tubos. Por último centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minuto.

Hoja de trabajo.
1. ¿Por qué utilizamos el control de albúmina?
Porque si aparece aglutinación en ese tubo se debe repetir la prueba pero usando un suero anti-D en medio salino. El tubo con albúmina debe dar siempre negativo.

2.¿ Que ocurre si no aparece aglutinación en el tubo D ?
Si no produce aglutinación en ninguno de los dos tubos procedemos a incubar ambos a 37ºC durante media hora. Posteriormente centrifugamos a 1000 rpm durante un minuto y observamos si existe o no aglutinación. En el caso de persistir la negatividad comprobaremos que le paciente no posee un Du ( D débil) mediante una prueba de Cooms indirecta.

3. ¿Que debemos detectar mediante un Coombs indirecto ?
La presencia de un Du (D débil )

4. ¿Cómo se prepara la muestra problema?

Para obtener la suspensión de hematíes lo primero que  realizamos es el lavados de los hematíes.

Para ello depositamos 1 ml de sangre y lo completamos con 3 ml de solución salina, lo agitamos y lo centrifugamos a 2000 rpm durante 4 minutos. Después desechamos el sobrenadante y volvemos a realizar el paso anterior 2 veces más. En la última centrifugación que realizamos desechamos el sobrenadante y preparamos hematíes al 5%. En un tubo depositamos 5 gotas (250 microlitros) de los hematíes lavados y 5 ml de suero fisiológico lo agitamos y así obtenemos una suspensión al 5 %.

Resultado obtenido.

	Aglutinación.
Sección D	Aglutinación
Sección A	No aglutina.

Valoración de los resultados.

La sangre analizada es:

Rh positivo

Práctica LIX: P4 (5/05/2015).

DETERMINACIÓN DEL GRUPO Rh EN PORTA.

Fundamento.
La finalidad de esta práctica es la detección del antígeno D en la superficie de los hematíes problema empleando anticuerpos Anti-D. En el caso de contener el antígeno D se observara aglutinación.

Materiales.

• Portaobjetos.
• Pipeta pasteur.
• Rotulador de vidrio.
• Palillos.
• Visualizador luminoso.

Reactivos.

• Suero anti-D
• Albúmina bovina al 30 %.

Muestra.

 Sangre anticoagulada.

Procedimiento.

Lo primero que hay que hacer es dividir el portaobjetos en dos partes, en el lado izquierdo marcamos con la letra S (suero ) y en el derecho con la letra A (albúmina ). Con una lanceta pinchamos el pulpejo del dedo, previamente desinfectado con alcohol, y con un capilar tomamos la sangre.

Depositamos una gota de suero anti-D en el lado izquierdo marcado con la  letra S (suero) y en el lado derecho marcado con la letra A (albúmina) depositamos una gota de albúmina bovina al 30 %.

En los dos lados del portaobjeto, a lado de la gota de suero anti-D y la albúmina depositamos una gota de sangre y con palillos distintos mezclamos ambas partes. Por últimos colocamos el portaobjeto en el visualizador luminoso que favorece la mezcla de sangre y reactivo y observamos si hay aglutinación.

Hoja de trabajo.

1. ¿Qué tipo de muestra empleamos en esta técnica?

Determinación del grupo Rh en porta.

2. ¿Para qué se utiliza el visualizador ?

Para favorecer la mezcla de sangre y reactivos y también para observar mejor el resultado de la reacción

3. ¿Qué puede dar lugar a falsos aglutinaciones?
Aparición de pequeños coágulos de fibrina.

4. ¿Qué ocurre si aglutina la sección A ?
No podemos informar del resultado de la prueba.

Resultado obtenido.

	Aglutinación.
Sección S	+
Sección A	-

Resultado Mesa 1

Valoración de los resultados.

La sangre analizada es : Rh positivo.

Gráfica.

Práctica LVII :P4 (27/04/2015)

DETERMINACIÓN SÉRICA DEL GRUPO AB0

Fundamento.
Cuando hacemos reaccionar el suero del paciente con hematíes conocidos del grupo A y del B, solo habrá aglutinación en el caso de ser enfrentado a hematíes con antígeno diferente a los hematíes propios del paciente. En esta práctica hemos utilizado plasma en lugar de suero.

Materiales.

• Tubos de centrifuga.
• Pipeta pasteur.
• Centrifuga.
• Reloj.
• Rotulador de vidrio.
• Vaso de precipitado.
• Gradilla.

Reactivos.

• Hematíes del grupo A1.
• Hematíes del grupo A2.
• Hematíes del grupoB.
• Hematíes del grupo 0.
• Hematíes de la sangre problema.

Muestra.

Plasma, obtenido centrifugando la sangre a 2500 durante 5 minutos.

Procedimiento.

Lo primero que realizamos es el lavados de los hematíes.

Para ello depositamos 1 ml de sangre y lo completamos con 3 ml de solución salina, lo agitamos y lo centrifugamos a 2000 rpm durante 4 minutos. Después desechamos el sobrenadante y volvemos a realizar el paso anterior 2 veces más. En la última centrifugación que realizamos desechamos el sobrenadante y preparamos hematíes al 5%. En un tubo depositamos 5 gotas (250 microlitros) de los hematíes lavados y 5 ml de suero fisiológico lo agitamos y así obtenemos una suspensión al 5 %.

Esta suspensión de hematíes al 5 % lo tenemos que hacer con sangre del grupo sanguíneo A1,A2, B y 0.

Para evitar falsos negativos, mantenemos el plasma en el baño de agua a 56 ºC durante 10 minutos, con ello inactivamos la muestra y evitamos fenómenos de hemólisis debido al complemento.

Después rotulamos 5 tubos de hemólisis, uno con la letra A1, otro con la letra A2, otro con B , otro con 0 , otro con C y para compensar la centrifuga rotulamos otro tubo repitiendo alguna de las letras.

 A estos 6 tubos le depositamos dos gotas de plasma problema y depositamos una gota de suspensión de hematíes que se corresponda con la letra rotulada en cada tubo y en el tubo C le añadimos suspensión de hematíes propio de la sangre problema y nos servirá de control. Agitamos los 6 tubos y lo centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minuto. Por último observamos si hay aglutinación.

Hoja de trabajo.

1.¿ Qué son los hematíes tipados?

Hematíes de grupo sanguíneo conocido.

2.¿A qué dilución empleamos los hematíes del paciente ?

Al 5%

3.¿Qué clase de muestra se emplea en esta técnica?

Suero o plasma.

4.¿Qué ocurre cuando el tubo C presenta aglutinación?

Que el grupo eritrocitario es ininterpretable y presenta autoanticuerpos.

Resultado obtenido.

	Aglutinación	No aglutinación.
Tubo A1		No aglutina
Tubo A2		No aglutina
Tubo B	Si aglutina
Tubo 0		No aglutina
Tubo C		No aglutina

Valoración de los resultados.

• Los A encontrados en el suero son: anti-B
• El grupo eritrocitario de la sangre analizada es: A1

La primera vez que la hicimos no salio nada porque la concentración de suero fisiológico estaba mal hecho. Pero los resultados que he puesto me salieron al repetir cuando repetí la práctica.

Práctica LVI:P4 (23/04/2015)

DETERMINACIÓN CELULAR EN TUBO.

Fundamento.

Los hematíes de deben enfrentar a sueros conocidos que tengan anticuerpos frente a los antígenos. Por último tenemos que observar si hay aglutinación o no en los hematíes.

Materiales.

• Tubos de centrifuga
• Rotulador de vidrio
• Pipeta pasteur 
• Centrífuga
• Gradilla.

Reactivos.

• Suero anti-A
• suero anti-B
• Suero anti-AB
• Solución salina fisiológico.

Muestra.

Es preferible utilizar una suspensión de los hematíes problemas.

Procedimiento.

Lo primero que realizamos es el lavados de los hematíes.
Para ello depositamos 1 ml de sangre y lo completamos con solución salina, lo agitamos y lo centrifugamos a 200 rpm durante 4 minutos. Después desechamos el sobrenadante y volvemos a realizar el paso anterior 2 veces más. En la última centrifugación que realizamos desechamos el sobrenadante y preparamos hematíes al 2 %. En un tubo depositamos 2 gotas de los hematíes lavados y 5 ml de suero fisiológico lo agitamos y así obtenemos una suspensión al 2 %.
Rotulamos 3 tubos de ensayo con las letras A, B y AB, a cada uno de estos tres tubos le depositamos una gota de suspensión de hematíes al 2 %. Luego estos tres tubos que son pequeños lo metemos dentro de otros tubos un poco más grande y al tubo A le depositamos dos gotas del suero anti-A , al tubo B le depositamos  dos gotas de suero anti-B y al tubo AB le depositamos dos gotas de suero anti-AB y agitamos los tubos . Por último tapamos cada tubo con papel parafim y lo centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minuto y observamos si hay aglutinación. Si hay aglutinación significa que pertenece a ese grupo sanguíneo.

Hoja de trabajo.
1. ¿Qué tipo de técnica inmunológica se emplea en este análisis ?
Determinación celular en tubo.

2. ¿A qué concentración se prepara la suspensión de hematíes problemas ?
Al 2 %

3. ¿Cómo se ve una aglutinación positiva ?
Se observa un botón de hematíes que permanecen unidos una vez desprendido el sedimento.

4. ¿A qué se debe el fenómeno de Rouleaux?
Consiste en una agrupación no específica de hematíes, que adoptan una imagen de pila de monedas.

5.¿Cómo se pueden evitar los falsos positivos ?
Con el lavado previo de los hematíes problema.

Resultado obtenido.
Se observa aglutinación en el tubo A y en el tubo AB (tubo de control)

Valoración de los resultados obtenidos.
 La sangre ensayada es del grupo eritrocitario:
A

Práctica LV :P4 .(22/04/2015)

DETERMINACIÓN CELULAR EN PORTA.

Fundamento.

Consiste en observar si hay aglutinación de los hematíes cuando vertemos anticuerpos conocidos.

Materiales.

• Portaobjetos.
• Pipeta pasteur.
• Palillos.
• Rotulador de vidrio.
• Lanceta
• Capilar
• Gasas 

Reactivos.

• Alcohol.
• Suero anti-A
• Suero anti-B

Muestra.

• Sangre capilar.

Procedimiento.

Lo primero que hay que hacer es dividir el portaobjetos en dos partes, en el lado izquierdo marcamos con la letra A y en el derecho con la letra B. Con una lanceta pinchamos el pulpejo del dedo, previamente desinfectado con alcohol, y con un capilar tomamos la sangre. 

 Después depositamos  una gota de suero anti-A en la sección A del portaobjetos y una gota de suero anti-B  en la sección B del portaobjetos , y situar una pequeña gota de sangre junto a la gota de antisuero. Posteriormente mezclamos ambas gotas con un palillo distinto en cada parte del portaobjeto. 

Por último observamos la presencia o ausencia de aglutinación.

Resultado.

Resultado de la Mesa 1 .

Hoja de trabajo.

1. ¿ Qué tipo de técnica inmunológica se emplea en este análisis ?

 Técnica  de la determinación celular en porta.

2. ¿Qué muestra utilizamos ?

 Sangre capilar  o sangre total anticoagulada, citratada u oxalatada.

3. ¿ Cómo se ve la aglutinación positiva ?

Aparecen unos grumos rojos que flotan en un líquido claro.

4. ¿Qué debemos hacer si el grupo obtenido es A ?

Los hematies problema deberán ser ensayados de nuevo con lectina  anti -A1;de forma que si se produce aglutinación, el sujeto pertenecerá al grupo A1.

Resultado obtenido.

 Aglutinación en la sección del porta del grupo A.

Valoración de los resultados.

La sangre analizada es del grupo eritrocitario :

A

Como el grupo obtenido ha sido el A, los hematíes deben ser ensayados de nuevo con el lectina anti- A1. Lo que hay que hacer en dividir otro portaobjetos por la mitad y poner en el lado izquierdo A1 y en el lado derecho A2 . Después depositamos una gota de sangre en la sección A y a lado de la gota depositamos una gota de lactina anti-A1. Si hay aglutinación en el A1  significa que pertenece al grupo sanguíneo A1 y si no aglutina sera del grupo sanguíneo A2. En esta caso ha aglutinado en A1 por lo tanto es del grupo sanguíneo A1.

Grupo sanguíneo A1

Gráfica grupos sanguíneos.

Práctica XLI :P3 (9/03/2015).

DETERMINACIÓN FUNCIONAL DE FIBRINÓGENO.

Fundamento.
El fibrinógeno se transforma en fibrina en presencia de exceso de trombina. El tiempo de formación del coagulo en esta practica es inversamente proporcional a la concentración de fibrinógeno presente ne la muestra del plasma. En presencia de altas concentración de trombina el tiempo de formación del coágulo en el plasma es inversamente proporcional a la concentración de fibrinógeno.

Materiales.

1. Pipeta graduada.
2. Micropipeta.
3. Cubetas de coagulometro.
4. Coagulometro.
5. Gradilla.

Reactivos.

• R1 : Trombina Bovina.

• R2: Tampón imidazol.

• R3: Solución caolín.

• Coagulation Cal.

Muestra.

Plasma pobre en plaquetas.

Procedimiento.

• Dilución 1/10 con la muestra (PPP) y R2 ( tampón imidazol) .Sería 50 microlitros de muestra más 450 microlitros de R2.
• Tomamos 5 tubos y lo rotulamos según su concentración, que sería 1/40, 1/30.1/20,1/10,1/5.

En el tubo 1/40 se le añade 3,9 ml de R2 y 100  microlitros de coagulation.

En el tubo 1/30 se le añade 2,9 ml de R2 y 100 microlitros de coagulation.

En el tubo 1/20 se le añade 1,9 ml de R2 y 100 microlitros de coagulation.

En el tubo 1/10 se le añade 0,9 ml de R2 y 100 microlitros de coagulation.

En el tubo 1/5 se le añade 0,4 ml de R2 y 100 microlitros de coagulation.

•  Añadimos  200 microlitros de cada dilución en cubetas de coagulometro y se le añade 20 microlitros de R3 y lo atemperamos a 37º durante 4 minutos.
• Añadimos 100 microlitros de reactivo R1 y cronometrar la formación del coágulo.

Hoja de trabajo.

1º. ¿ De qué tipo es la determinación de fibrinógeno realizada en esta práctica?

Esta práctica se basa en la medición del tiempo que tarda un exceso de trombina en degradar a fibrina el fibrinógeno presente en un PPP diluido y, por tanto, en formar un coagulo.

2º. ¿A qué concentración está la trombina bovina?

A una concentración de 100 U NIH/ml.

3º. ¿A qué dilución se somete a la muestra?

A 1/10

4.º¿Cuál es la fibrinogenemia normal?
La fibrinogenemia normal oscila entre los 150 y los 450 mg/dl.

Resultados obtenidos.

Curva del fibrinogeno.

Dilución del plasma calibrador.	Concentración.	Tiempo en el que coagula.
1/40	0,25*xC	48,5
1/30	0,33*xC	37,4
1/20	0,5*xC	9,4
1/10	1*xC	142,7
1/5	2*xC	7

Tiempos obtenido en el coagulómetro.

Tiempo, en segundos, en el que coagula la muestra:

10 segundos.

Valoración de los resultados.

La fibrinogenemia es:
Normal.

Práctica XLV : P3. (10/3/20154)

PRUEBA DE MEZCLA CON PLASMA NORMAL.

Fundamento.

En esta práctica vamos a mezclar en cantidades iguales de pool de plasma y plasma pobre en plaquetas anormal, para determinar el tiempo de protrombina.

Materiales.

1. Gradilla,
2. Cubeta de coagulometro.
3. Trocitos de acero.
4. Un rotulador de vidrio.
5. Una coagulometro.
6. Un micropipeta de de 100 microlitros.
7. Una baño de agua.
8. Tubo de ensayo de plástico.

Reactivos.

• Solución de cloruro calcico 0,025 M
• Una cefalina activa con ácido elagico.
• Pool de plasma normales.

Muestra.

Plasma pobre en plaquetas.

Procedimiento.

1. Lo primero que hay que hacer es mezclar 100 microlitros de pool de plasma con 100 microlitros de plasma pobre en plaquetas anormal.

PPP anómalo.	100 uL
Pool de plasma normales o Plasma control normal.	100 uL
Dilución.	1/2

1. Lo incubamos en el baño de agua a 37ºC durante 60 minutos.
2. Tomamos 200 microlitros de cloruro calcico añadimos en un tubo de plastico y lo incubamos en el baño durante 5 minutos a 37 ºC.
3. Tomamos dos cubetas de coagulometro, le introducimos en trozo de acero y lo rotulamos como M1 y M2.
4. A las cubetas M1 Y M2 le añadimos 100 microlitros de la dilución anterior ( 100 microlitros de PPP anormal y 100 microlitros de pool de plasma) y también le añado 100 microlitros de cefalina.
5. En el coagulometro lo ponemos en la celda adecuada y le ponemos encima en tapón rojo y se le añade 100 microlitros de cloruro calcico después le pulso Reser y empieza a contar el tiempo que tarda en coagula; el mismo proceso se realiza para la cubeta M2.

Resultado.

M1: 60segundos.
M2:68 segundos.

Hoja de trabajo.

1.º ¿Cuándo debe hacerse una prueba de mezcla con plasma normal?

Se practica generalmente cuando en el plasma problema se determina un TP normal y un TTPA alargado. En estas circunstancias se supone que el paciente sufre un déficit de algún factor de la vía intrínseca y, en concreto , de los factores VII, IX,XI o XII.

2.º Si tras la mezcla con plasma normal, no se corrige el TTPA, ¿ qué se debe investigar?

Si el TTPA de la mezcla no se corrige con respecto al del PPP problema puro, el trastorno coagulatorio se debe a otros motivos como, por ejemplo , a la actuación de sustancias inhibidoras de la coagulación.

Resultados obtenidos.

Tras la mezcla del plasma problema anómalo con plasma normal:
Se ha corregido el TTPA.

Valoración de los resultados.

La prueba realizada indica:

La ausencia de algún factor de la vía intrínseca de la coagulación en el plasma anómalo.

Pruebas que investigan la coagulación. (2 /03/2015)

Tiempo de coagulación.

Fundamento.

Determinar el tiempo que tarda en coagularse la sangre en un capilar.

Materiales.

• Capilar sin heparina.
• Baño de agua.
• Lanceta.
• Algodón.

Reactivo.

Alcohol.

Muestra.

Sangre venosa sin anticoagulante.

Procedimiento.

1. Se sitúa la muestra dentro de un tubo de vidrio.
2. Se incuba a 37º C.
3. Se cuenta el tiempo trascurrido desde el deposito de la sangre en el tubo hasta la aparicion de un coagulo en el interior del tubo.
4. Los valores normales se sitúan entre los 5- 10 minutos.

Resultado.

Se tardo 3 minutos.

Esta prueba ya esta en desuso.

Práctica XXVI:P3 (2/03/2015)

DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR (VSG)

Fundamento.

La sangre se coloca en un tubo que esta dispuesto verticalmente, de este modo la sangre por acción de la gravedad se desplaza hacia el fondo del tubo. Este proceso normalmente es lento porque la acción con la que es atraído los hematíes es casi compensada por la fuerza ascendente creada por el plasma al desplazarse hacia arriba.

Materiales.

1. Pipeta de vidrio desechable que agrega en su interior una embolo de aspiración de plástico.
2. Una gradilla
3. Un tubo con citrato sódico con tapón de goma perforable.
4. Reloj.

Reactivos.

Citrato sódico 3,8 %

Muestra.

Sangre fresca.

Procedimiento.

Lo primero que debemos de hacer es llenar el tubo con citrato sódico con sangre fresca, después lo mezclamos agitando suavemente y por boca del tubo le introducimos la pipeta desechable que se debe llenar con la sangre hasta el algodón. Realizar la lectura a la primera hora y ala segunda hora.

Resultado.

• Sexo del paciente : Varón.

Primera hora = 5 mm

Segunda hora=10 mm

Valoración de los resultados.

Teniendo en cuenta el sexo del paciente, la VSG obtenida es:

Normal.

Hoja de trabajo.

1.º ¿Cómo se llama la carga electrostática negativa de los glóbulos rojos?

Potencia Z.

2.º ¿Qué anticoagulante es el más apropiado para realizar una determinación de la VSG?

Citrato sodico al 3,8 %

3.º ¿ A que temperatura se recomienda practicar la determinación de la VSG ?

A temperatura ambiente a unos 27º

4º. ¿Qué ocurre si la pipeta de VSG esta inclinada durante la determinación?

Que no bajara al mismo ritmo que si lo esta verticalmente bien.

5º. ¿En que circunstancia fisiologica aumenta la VSG?

En presencia de patología aumenta en la vejez y a partir del tercer mes de embarazo.

6º. ¿A que tiempos se efectúa la lectura del VSG?

A la primera y segundo hora.

Práctica XXXIX :P3 (4/03/2015) .

DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA (TTPA)

Fundamento.
Esta práctica se realiza introduciendo en un tubo PPP (plasma pobre plaquetas) y añadiendo cloruro cálcico utilizando el coagulómetro.
El sustituto del factor 3 plaquetario es un dilución fosfolipida creada con cerebros de conejo llama cefalina.

Material.

• Una gradilla.
• 2 cubetas.
• 2 trocitos de acero.
• Un rotulador.
• Micropipeta de 100 microlitros.
• 7 puntas de micropipeta.
• Un coagulómetro.
• 4 tubos de ensayo de plástico.

Reactivos.

• Cloruro cálcico.
• Cefalina activada.
• Pool de plasmas normales.

Muestra.

Un plasma pobre en plaquetas (PPP).

Procedimiento.

Lo primero que hacemos en centrifugar la sangre a 3000 rpm durante 10 minuto para obtener plasma pobre en plaquetas. Rotular dos cubetas, uno con la letra M ( de muestra) y otro con la letra C ( de control). Añadimos con una micropipeta 100 microlitros de muestra al tubo M y 100 microlitros de plasma control normal en el tubo C; también se le añade 100 microlitros de cefalina. En las dos cubetas le introducimos un trocito de acero y lo dejamos alentar en las celdas del coagulómetro 2 minutos. Por último en el coagulometro, se coloca la cubeta en la celda adecuada y se le añade 100 microlitros de cloruro cálcico para que el magnetoagitador se ponga en marcha y comience la lectura.

Hoja de trabajo.
1º. ¿De dónde se obtiene el sustituto de f3p?
De una suspensión de fosfolípidos, obtenida a partir de cerebros de conejo, que recibe el nombre de cefalina.

2º.¿Cómo se llama el sustituto del f3p?
Se llama cefalina.

3º.¿Qué activadores de los fatores de contacto se pueden utilizar?
Como activadores de los factores de contacto se pueden utilizar varias sustancias, entre las que cabe destacar : el caolín, el polvo de vidrio, el sílice, el celite y el ácido elágico.

4º. ¿Cuántos segundos debe superar el TTPA de la muestra al del control para ser considerado anormal?
Se considera anormal un TTPA de la muestra superior, en más de 8 segundos, al del control.

Resultado obtenido.
TTPA de la muestra:
116,6 segundos.

TTPA del control.
28,1 segundos.

Diferencia entre el TTPA de la muestra y el TTPA del control :
116-28,1 = 88,5 segundos.
Cociente entre el TTPA de la muestra y el TTPA del control:
116,6/28,1 =4,4 segundos.

Valoración de los resultados.
La muestra ensayada tiene un TTPA:
Alargado.