Práctica LX: P4 (5/05/2015)

DETERMINACIÓN DEL GRUPO Rh EN TUBO.

Fundamento.

El objetivo es la detección  del antígeno D en la superficie de los hematíes enfrentándolo a un suero anti-D.

Materiales.

• Tubos de hemólisis.
• Rotulador de vidrio.
• Gradilla.
• Pipeta Pasteur.
• Centrífuga.

Reactivos.

• Suero anti-D.
• Albúmina bovina al 30%
• Solución salina fisiológica.

Muestra.

Suspensión de hematíes al 5%.

Para obtener la suspensión de hematíes lo primero que  realizamos es el lavados de los hematíes.

Para ello depositamos 1 ml de sangre y lo completamos con 3 ml de solución salina, lo agitamos y lo centrifugamos a 2000 rpm durante 4 minutos. Después desechamos el sobrenadante y volvemos a realizar el paso anterior 2 veces más. En la última centrifugación que realizamos desechamos el sobrenadante y preparamos hematíes al 5%. En un tubo depositamos 5 gotas (250 microlitros) de los hematíes lavados y 5 ml de suero fisiológico lo agitamos y así obtenemos una suspensión al 5 %.
 Procedimiento.
Primero rotulamos dos tubos, una con la letra D y otro con la letra A. El en tubo D le depositamos una gota de suero anti-Dy en el tubo A le depositamos una gota de albumina bovina al 30% y agitamos. A los dos tubos le depositamos una gota de la suspensión de hematíes al 5%3 y agitamos los tubos. Por último centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minuto.

Hoja de trabajo.
1. ¿Por qué utilizamos el control de albúmina?
Porque si aparece aglutinación en ese tubo se debe repetir la prueba pero usando un suero anti-D en medio salino. El tubo con albúmina debe dar siempre negativo.

2.¿ Que ocurre si no aparece aglutinación en el tubo D ?
Si no produce aglutinación en ninguno de los dos tubos procedemos a incubar ambos a 37ºC durante media hora. Posteriormente centrifugamos a 1000 rpm durante un minuto y observamos si existe o no aglutinación. En el caso de persistir la negatividad comprobaremos que le paciente no posee un Du ( D débil) mediante una prueba de Cooms indirecta.

3. ¿Que debemos detectar mediante un Coombs indirecto ?
La presencia de un Du (D débil )

4. ¿Cómo se prepara la muestra problema?

Para obtener la suspensión de hematíes lo primero que  realizamos es el lavados de los hematíes.

Para ello depositamos 1 ml de sangre y lo completamos con 3 ml de solución salina, lo agitamos y lo centrifugamos a 2000 rpm durante 4 minutos. Después desechamos el sobrenadante y volvemos a realizar el paso anterior 2 veces más. En la última centrifugación que realizamos desechamos el sobrenadante y preparamos hematíes al 5%. En un tubo depositamos 5 gotas (250 microlitros) de los hematíes lavados y 5 ml de suero fisiológico lo agitamos y así obtenemos una suspensión al 5 %.

Resultado obtenido.

	Aglutinación.
Sección D	Aglutinación
Sección A	No aglutina.

Valoración de los resultados.

La sangre analizada es:

Rh positivo

Práctica LIX: P4 (5/05/2015).

DETERMINACIÓN DEL GRUPO Rh EN PORTA.

Fundamento.
La finalidad de esta práctica es la detección del antígeno D en la superficie de los hematíes problema empleando anticuerpos Anti-D. En el caso de contener el antígeno D se observara aglutinación.

Materiales.

• Portaobjetos.
• Pipeta pasteur.
• Rotulador de vidrio.
• Palillos.
• Visualizador luminoso.

Reactivos.

• Suero anti-D
• Albúmina bovina al 30 %.

Muestra.

 Sangre anticoagulada.

Procedimiento.

Lo primero que hay que hacer es dividir el portaobjetos en dos partes, en el lado izquierdo marcamos con la letra S (suero ) y en el derecho con la letra A (albúmina ). Con una lanceta pinchamos el pulpejo del dedo, previamente desinfectado con alcohol, y con un capilar tomamos la sangre.

Depositamos una gota de suero anti-D en el lado izquierdo marcado con la  letra S (suero) y en el lado derecho marcado con la letra A (albúmina) depositamos una gota de albúmina bovina al 30 %.

En los dos lados del portaobjeto, a lado de la gota de suero anti-D y la albúmina depositamos una gota de sangre y con palillos distintos mezclamos ambas partes. Por últimos colocamos el portaobjeto en el visualizador luminoso que favorece la mezcla de sangre y reactivo y observamos si hay aglutinación.

Hoja de trabajo.

1. ¿Qué tipo de muestra empleamos en esta técnica?

Determinación del grupo Rh en porta.

2. ¿Para qué se utiliza el visualizador ?

Para favorecer la mezcla de sangre y reactivos y también para observar mejor el resultado de la reacción

3. ¿Qué puede dar lugar a falsos aglutinaciones?
Aparición de pequeños coágulos de fibrina.

4. ¿Qué ocurre si aglutina la sección A ?
No podemos informar del resultado de la prueba.

Resultado obtenido.

	Aglutinación.
Sección S	+
Sección A	-

Resultado Mesa 1

Valoración de los resultados.

La sangre analizada es : Rh positivo.

Gráfica.

Práctica LVII :P4 (27/04/2015)

DETERMINACIÓN SÉRICA DEL GRUPO AB0

Fundamento.
Cuando hacemos reaccionar el suero del paciente con hematíes conocidos del grupo A y del B, solo habrá aglutinación en el caso de ser enfrentado a hematíes con antígeno diferente a los hematíes propios del paciente. En esta práctica hemos utilizado plasma en lugar de suero.

Materiales.

• Tubos de centrifuga.
• Pipeta pasteur.
• Centrifuga.
• Reloj.
• Rotulador de vidrio.
• Vaso de precipitado.
• Gradilla.

Reactivos.

• Hematíes del grupo A1.
• Hematíes del grupo A2.
• Hematíes del grupoB.
• Hematíes del grupo 0.
• Hematíes de la sangre problema.

Muestra.

Plasma, obtenido centrifugando la sangre a 2500 durante 5 minutos.

Procedimiento.

Lo primero que realizamos es el lavados de los hematíes.

Para ello depositamos 1 ml de sangre y lo completamos con 3 ml de solución salina, lo agitamos y lo centrifugamos a 2000 rpm durante 4 minutos. Después desechamos el sobrenadante y volvemos a realizar el paso anterior 2 veces más. En la última centrifugación que realizamos desechamos el sobrenadante y preparamos hematíes al 5%. En un tubo depositamos 5 gotas (250 microlitros) de los hematíes lavados y 5 ml de suero fisiológico lo agitamos y así obtenemos una suspensión al 5 %.

Esta suspensión de hematíes al 5 % lo tenemos que hacer con sangre del grupo sanguíneo A1,A2, B y 0.

Para evitar falsos negativos, mantenemos el plasma en el baño de agua a 56 ºC durante 10 minutos, con ello inactivamos la muestra y evitamos fenómenos de hemólisis debido al complemento.

Después rotulamos 5 tubos de hemólisis, uno con la letra A1, otro con la letra A2, otro con B , otro con 0 , otro con C y para compensar la centrifuga rotulamos otro tubo repitiendo alguna de las letras.

 A estos 6 tubos le depositamos dos gotas de plasma problema y depositamos una gota de suspensión de hematíes que se corresponda con la letra rotulada en cada tubo y en el tubo C le añadimos suspensión de hematíes propio de la sangre problema y nos servirá de control. Agitamos los 6 tubos y lo centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minuto. Por último observamos si hay aglutinación.

Hoja de trabajo.

1.¿ Qué son los hematíes tipados?

Hematíes de grupo sanguíneo conocido.

2.¿A qué dilución empleamos los hematíes del paciente ?

Al 5%

3.¿Qué clase de muestra se emplea en esta técnica?

Suero o plasma.

4.¿Qué ocurre cuando el tubo C presenta aglutinación?

Que el grupo eritrocitario es ininterpretable y presenta autoanticuerpos.

Resultado obtenido.

	Aglutinación	No aglutinación.
Tubo A1		No aglutina
Tubo A2		No aglutina
Tubo B	Si aglutina
Tubo 0		No aglutina
Tubo C		No aglutina

Valoración de los resultados.

• Los A encontrados en el suero son: anti-B
• El grupo eritrocitario de la sangre analizada es: A1

La primera vez que la hicimos no salio nada porque la concentración de suero fisiológico estaba mal hecho. Pero los resultados que he puesto me salieron al repetir cuando repetí la práctica.

Práctica LVI:P4 (23/04/2015)

DETERMINACIÓN CELULAR EN TUBO.

Fundamento.

Los hematíes de deben enfrentar a sueros conocidos que tengan anticuerpos frente a los antígenos. Por último tenemos que observar si hay aglutinación o no en los hematíes.

Materiales.

• Tubos de centrifuga
• Rotulador de vidrio
• Pipeta pasteur 
• Centrífuga
• Gradilla.

Reactivos.

• Suero anti-A
• suero anti-B
• Suero anti-AB
• Solución salina fisiológico.

Muestra.

Es preferible utilizar una suspensión de los hematíes problemas.

Procedimiento.

Lo primero que realizamos es el lavados de los hematíes.
Para ello depositamos 1 ml de sangre y lo completamos con solución salina, lo agitamos y lo centrifugamos a 200 rpm durante 4 minutos. Después desechamos el sobrenadante y volvemos a realizar el paso anterior 2 veces más. En la última centrifugación que realizamos desechamos el sobrenadante y preparamos hematíes al 2 %. En un tubo depositamos 2 gotas de los hematíes lavados y 5 ml de suero fisiológico lo agitamos y así obtenemos una suspensión al 2 %.
Rotulamos 3 tubos de ensayo con las letras A, B y AB, a cada uno de estos tres tubos le depositamos una gota de suspensión de hematíes al 2 %. Luego estos tres tubos que son pequeños lo metemos dentro de otros tubos un poco más grande y al tubo A le depositamos dos gotas del suero anti-A , al tubo B le depositamos  dos gotas de suero anti-B y al tubo AB le depositamos dos gotas de suero anti-AB y agitamos los tubos . Por último tapamos cada tubo con papel parafim y lo centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minuto y observamos si hay aglutinación. Si hay aglutinación significa que pertenece a ese grupo sanguíneo.

Hoja de trabajo.
1. ¿Qué tipo de técnica inmunológica se emplea en este análisis ?
Determinación celular en tubo.

2. ¿A qué concentración se prepara la suspensión de hematíes problemas ?
Al 2 %

3. ¿Cómo se ve una aglutinación positiva ?
Se observa un botón de hematíes que permanecen unidos una vez desprendido el sedimento.

4. ¿A qué se debe el fenómeno de Rouleaux?
Consiste en una agrupación no específica de hematíes, que adoptan una imagen de pila de monedas.

5.¿Cómo se pueden evitar los falsos positivos ?
Con el lavado previo de los hematíes problema.

Resultado obtenido.
Se observa aglutinación en el tubo A y en el tubo AB (tubo de control)

Valoración de los resultados obtenidos.
 La sangre ensayada es del grupo eritrocitario:
A

Práctica LV :P4 .(22/04/2015)

DETERMINACIÓN CELULAR EN PORTA.

Fundamento.

Consiste en observar si hay aglutinación de los hematíes cuando vertemos anticuerpos conocidos.

Materiales.

• Portaobjetos.
• Pipeta pasteur.
• Palillos.
• Rotulador de vidrio.
• Lanceta
• Capilar
• Gasas 

Reactivos.

• Alcohol.
• Suero anti-A
• Suero anti-B

Muestra.

• Sangre capilar.

Procedimiento.

Lo primero que hay que hacer es dividir el portaobjetos en dos partes, en el lado izquierdo marcamos con la letra A y en el derecho con la letra B. Con una lanceta pinchamos el pulpejo del dedo, previamente desinfectado con alcohol, y con un capilar tomamos la sangre. 

 Después depositamos  una gota de suero anti-A en la sección A del portaobjetos y una gota de suero anti-B  en la sección B del portaobjetos , y situar una pequeña gota de sangre junto a la gota de antisuero. Posteriormente mezclamos ambas gotas con un palillo distinto en cada parte del portaobjeto. 

Por último observamos la presencia o ausencia de aglutinación.

Resultado.

Resultado de la Mesa 1 .

Hoja de trabajo.

1. ¿ Qué tipo de técnica inmunológica se emplea en este análisis ?

 Técnica  de la determinación celular en porta.

2. ¿Qué muestra utilizamos ?

 Sangre capilar  o sangre total anticoagulada, citratada u oxalatada.

3. ¿ Cómo se ve la aglutinación positiva ?

Aparecen unos grumos rojos que flotan en un líquido claro.

4. ¿Qué debemos hacer si el grupo obtenido es A ?

Los hematies problema deberán ser ensayados de nuevo con lectina  anti -A1;de forma que si se produce aglutinación, el sujeto pertenecerá al grupo A1.

Resultado obtenido.

 Aglutinación en la sección del porta del grupo A.

Valoración de los resultados.

La sangre analizada es del grupo eritrocitario :

A

Como el grupo obtenido ha sido el A, los hematíes deben ser ensayados de nuevo con el lectina anti- A1. Lo que hay que hacer en dividir otro portaobjetos por la mitad y poner en el lado izquierdo A1 y en el lado derecho A2 . Después depositamos una gota de sangre en la sección A y a lado de la gota depositamos una gota de lactina anti-A1. Si hay aglutinación en el A1  significa que pertenece al grupo sanguíneo A1 y si no aglutina sera del grupo sanguíneo A2. En esta caso ha aglutinado en A1 por lo tanto es del grupo sanguíneo A1.

Grupo sanguíneo A1

Gráfica grupos sanguíneos.

Práctica XLI :P3 (9/03/2015).

DETERMINACIÓN FUNCIONAL DE FIBRINÓGENO.

Fundamento.
El fibrinógeno se transforma en fibrina en presencia de exceso de trombina. El tiempo de formación del coagulo en esta practica es inversamente proporcional a la concentración de fibrinógeno presente ne la muestra del plasma. En presencia de altas concentración de trombina el tiempo de formación del coágulo en el plasma es inversamente proporcional a la concentración de fibrinógeno.

Materiales.

1. Pipeta graduada.
2. Micropipeta.
3. Cubetas de coagulometro.
4. Coagulometro.
5. Gradilla.

Reactivos.

• R1 : Trombina Bovina.

• R2: Tampón imidazol.

• R3: Solución caolín.

• Coagulation Cal.

Muestra.

Plasma pobre en plaquetas.

Procedimiento.

• Dilución 1/10 con la muestra (PPP) y R2 ( tampón imidazol) .Sería 50 microlitros de muestra más 450 microlitros de R2.
• Tomamos 5 tubos y lo rotulamos según su concentración, que sería 1/40, 1/30.1/20,1/10,1/5.

En el tubo 1/40 se le añade 3,9 ml de R2 y 100  microlitros de coagulation.

En el tubo 1/30 se le añade 2,9 ml de R2 y 100 microlitros de coagulation.

En el tubo 1/20 se le añade 1,9 ml de R2 y 100 microlitros de coagulation.

En el tubo 1/10 se le añade 0,9 ml de R2 y 100 microlitros de coagulation.

En el tubo 1/5 se le añade 0,4 ml de R2 y 100 microlitros de coagulation.

•  Añadimos  200 microlitros de cada dilución en cubetas de coagulometro y se le añade 20 microlitros de R3 y lo atemperamos a 37º durante 4 minutos.
• Añadimos 100 microlitros de reactivo R1 y cronometrar la formación del coágulo.

Hoja de trabajo.

1º. ¿ De qué tipo es la determinación de fibrinógeno realizada en esta práctica?

Esta práctica se basa en la medición del tiempo que tarda un exceso de trombina en degradar a fibrina el fibrinógeno presente en un PPP diluido y, por tanto, en formar un coagulo.

2º. ¿A qué concentración está la trombina bovina?

A una concentración de 100 U NIH/ml.

3º. ¿A qué dilución se somete a la muestra?

A 1/10

4.º¿Cuál es la fibrinogenemia normal?
La fibrinogenemia normal oscila entre los 150 y los 450 mg/dl.

Resultados obtenidos.

Curva del fibrinogeno.

Dilución del plasma calibrador.	Concentración.	Tiempo en el que coagula.
1/40	0,25*xC	48,5
1/30	0,33*xC	37,4
1/20	0,5*xC	9,4
1/10	1*xC	142,7
1/5	2*xC	7

Tiempos obtenido en el coagulómetro.

Tiempo, en segundos, en el que coagula la muestra:

10 segundos.

Valoración de los resultados.

La fibrinogenemia es:
Normal.

Práctica XLV : P3. (10/3/20154)

PRUEBA DE MEZCLA CON PLASMA NORMAL.

Fundamento.

En esta práctica vamos a mezclar en cantidades iguales de pool de plasma y plasma pobre en plaquetas anormal, para determinar el tiempo de protrombina.

Materiales.

1. Gradilla,
2. Cubeta de coagulometro.
3. Trocitos de acero.
4. Un rotulador de vidrio.
5. Una coagulometro.
6. Un micropipeta de de 100 microlitros.
7. Una baño de agua.
8. Tubo de ensayo de plástico.

Reactivos.

• Solución de cloruro calcico 0,025 M
• Una cefalina activa con ácido elagico.
• Pool de plasma normales.

Muestra.

Plasma pobre en plaquetas.

Procedimiento.

1. Lo primero que hay que hacer es mezclar 100 microlitros de pool de plasma con 100 microlitros de plasma pobre en plaquetas anormal.

PPP anómalo.	100 uL
Pool de plasma normales o Plasma control normal.	100 uL
Dilución.	1/2

1. Lo incubamos en el baño de agua a 37ºC durante 60 minutos.
2. Tomamos 200 microlitros de cloruro calcico añadimos en un tubo de plastico y lo incubamos en el baño durante 5 minutos a 37 ºC.
3. Tomamos dos cubetas de coagulometro, le introducimos en trozo de acero y lo rotulamos como M1 y M2.
4. A las cubetas M1 Y M2 le añadimos 100 microlitros de la dilución anterior ( 100 microlitros de PPP anormal y 100 microlitros de pool de plasma) y también le añado 100 microlitros de cefalina.
5. En el coagulometro lo ponemos en la celda adecuada y le ponemos encima en tapón rojo y se le añade 100 microlitros de cloruro calcico después le pulso Reser y empieza a contar el tiempo que tarda en coagula; el mismo proceso se realiza para la cubeta M2.

Resultado.

M1: 60segundos.
M2:68 segundos.

Hoja de trabajo.

1.º ¿Cuándo debe hacerse una prueba de mezcla con plasma normal?

Se practica generalmente cuando en el plasma problema se determina un TP normal y un TTPA alargado. En estas circunstancias se supone que el paciente sufre un déficit de algún factor de la vía intrínseca y, en concreto , de los factores VII, IX,XI o XII.

2.º Si tras la mezcla con plasma normal, no se corrige el TTPA, ¿ qué se debe investigar?

Si el TTPA de la mezcla no se corrige con respecto al del PPP problema puro, el trastorno coagulatorio se debe a otros motivos como, por ejemplo , a la actuación de sustancias inhibidoras de la coagulación.

Resultados obtenidos.

Tras la mezcla del plasma problema anómalo con plasma normal:
Se ha corregido el TTPA.

Valoración de los resultados.

La prueba realizada indica:

La ausencia de algún factor de la vía intrínseca de la coagulación en el plasma anómalo.