Práctica XIX: P2 (22/01/2015).

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE HIERRO IVD.

Materiales.

• Gradilla.
• Cuatro tubos de ensayo.
• Una micropipeta de 1000 microlitros.
• Vaso de precipitado.
• Una pipeta.
• Espectofotometro.

Reactivos.

R1 Tampón	Acetato pH 4,9                  100mmol/L
R2 Reductor.	Ácido ascórbico                99,7%
R3 Color.	FerroZine                            40 mmol/L
IRON CAL.	Patrón primario acuoso de Hierro   100 ug/dL

IRON CAL.

 Ácido ascórbico.

 Acetato pH 4,9

Muestra.

Sangre.

Procedimiento.

Lo primero que debemos de hacer es preparar el reactivo de trabajo (RT), este reactivo se prepara disolviendo el tubo de R2 Reductor ( Ácido ascórbico 99,7% ) en el frasco de R1 Tampón ( Acetato pH 4,9  100mmol/L) , tapamos R1 y lo  mezclamos para que se disuelva correctamente R2 con R1, este sera RT ( reactivo de trabajo ) y también tenemos que poner en un vaso de precipitado agua destilada y tenemos que tener a mano la muestra que es el plasma.

Realizado ya el reactivo de trabajo lo que vamos hacer es coger cuatro tubos de ensayo, y escribirle a uno  Blanco RT, a otro Patrón , a otro blanco muestra y al último muestra. Después con una micropipeta añadimos 1 mL (1000 microlitros ) al Blanco RT, patrón, blanco muestra y muestra; también vamos a añadir una gota de R3 color ( Ferrozine  40mmol/ L) al tubo blanco RT, al patrón y a la muestra. Con una micropipeta añadimos 200 microlitros de agua destilada  al blanco RT , le cambiamos la punta y con la misma micripipeta añadimos 200 microlitros de patrón al tubo de patrón y por último añadimos 200 microlitros de muestra a blanco muestra y muestra. Tenemos que tener en cuenta que cuando le añadimos a los tubos mas de una sustancia lo tenemos que mezclar con la micropipeta.

La muestra se debe mantener durante 10 minutos a temperatura ambiente.

	Blanco RT	Patrón	Blanco muestra	Muestra
RT (mL)	1,0	1,0	1,0	1,0
R3 (gotas)	1	1	--	1
Agua destilada (uL)	200	--	--	--
Patrón (uL)	--	200	--	--
Muestra (uL)	--	--	200	200

Con los cuatro tubos de ensayo con sus respectivo nombres vamos al espectrofotómetro y lo primero que hacemos después de prenderlo es poner la fecha y aplastar enter, pulsamos el número 1 ( absorbancia ), pulsamos el número 1 (monocromática), pulsamos el número 5 (540 nm ) y enter , volumen muestra pulsamos número 100 y enter, tiempo pulsar el número 0 y enter, temperatura pulsar el número 0 y enter, después introducimos el blanco y pulsamos PUMP , introducimos el patrón y pulsamos PUMP, introducimos blanco muestra y pulsar PUMP y por último introducimos la muestra y pulsar PUMP y lo último que introducimos en agua destilada y mantenemos pulsamos WASH hasta que absorba toda el agua. Cuando introducimos el blanco RT, patrón, blanco muestra y muestra tenemos que esperar hasta que lo absorba dos veces para retirarlo y en cada absorbida saldra unos valores que son los resultados.

Procedimiento de utilización del espectrofotómetro.

Resultado.
Blanco RT =0,196
Patrón =0,075
Blanco muestra=0,069
Muestra =0,1

((Muestra-Blanco muestra)/Patrón))x100
((0,1-0,069)/0,075 )x100 = 41,33 %

Hoja de trabajo.
1º. ¿Cuál es el reactivo cromógeno de esta técnica?

2º. ¿Por qué tenemos un tubo BR?

3º. ¿Qué muestras no son válidas?