Práctica XXII:P2 (29/01/2015)

ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINAS.

Material.

• Tiras de cellogel 2,5x17 cm.
• Aplicador de electroforesis semimicro.
• Rodillo.
• Bandeja.
• Fuente de alimentación.
• Cubeta.
• Puente.
• Placa de vidrio.
• Cuatro pipetas parteur.
• Vaso de precipitado.

Reactivo.

• Suero fisiológico.
• Agua destilada.
• Solución decolorante: Solución Ácido acetico 5%.
• Solución transparentadora de electroforesis.
• Cloroformo ( troclorometano )
• Metanol
• Tampon pH 8,8.
• Colorante : Negro amido.

Muestra.

Sangre anticoagulada.

Procedimiento.

 Lo primero que hay que hacer es la preparación de la muestra que se prepara de la siguiente manera:

Lo primero que debemos de hacer es tomar 3 ml de sangre anti coagulada y depositarla en un tubo de centrifuga de cristal cónico graduado. 

Debemos de tener tres pipetas pasteur, una para el suero fisiologico, otra para sacar el sobrenadante y la última para mezclar.

Cuando tengamos la sangre en el tubo la centrifugamos a 3500 rpm durante 10  minutos, pasado este tiempo lo que hacemos es quitar el sobrenadante con la pipeta pasteur y poner 4 ml de suero fisiológico , lo mezclamos y lo volvemos a centrifugar. Esta operación la debemos de realizar dos veces más. En el último lavado lo que debemos de hacer es quitar el sobrenadante y  y depositar a la sangre que ha quedado en el tubo 0,5 ml de cloroformo que lo tomamos con una micropipeta de  50 microlitro y 1,5 ml de agua destilada que lo podemos hacer con una pipeta pasteur y por último lo mezclamos y lo centrifugamos a 3500 rpm durante 20 minutos.

 Lo importante es que el tubo tenga la misma cantidad que un segundo tubo para enfrentarlo en la centrifugadora.

Pasado los 20 minutos tenemos que coger el sobrenadante y depositarlo en otro tubo de ensayo, este sobrenadante sera la muestra con la que vamos a trabajar.

Ahora se realizara la electroforesis.

Tenemos que colocar la fuente de alimentación, la cubeta y los electrodos correctamente. 

Ponemos el tampon en la cubeta y ahi se colocara las tiras que previamente sacaremos del frigorífico con las pinzas y la colocaremos en la cubeta con tampon durante 10 minutos. Sacamos las tiras y las secamos con papel de filtro y la montamos en el puente con la cara absorbante hacia arriba es decir poniendo la esquina cortada en la derecha mirando hacia la persona y  los dos extremos tocando el tampon , para ellos los extremos deben pasar por las ranuras del puente..

Aplicación de la muestra.

A la tira le hacemos una línea con lápiz en el extremo catodico y con una capilar debajo de la señal hacemos una linea pero con la sangre esta linea debe ser muy fina y con poca sangre.

Después ponemos el punte dentro de la cubeta y ponemos en marcha el alimentador a 400 voltios durante 10 minutos.

Cuando ya ha terminado la electroforesis debemos desconectarlo y sacamos las tiras con unas pinzas y la depositamos en una cubeta que previamente la hemos llenado con negro amido durante 10 minutos y tiene que estar constantemente agitandose. Cuando termine debemos retirar el negro amido y ponemos la tira en otro cubeta llenada con ácido acetico 5% durante 10 minutos y debe estar agitandose , este paso se debe hacer 3 veces. Hecho tres veces este paso lo ponemos en la cubeta con metanol durante 1 minuto y finalmente la ponemos en la cubeta con la sulución transparentadora durante 2 minutos. En todos estos pasos la cara absorbente de la tira debe estar hacia abajo.

 Pasado este tiempo la ponemos en la placa de vidrio con la cara absorbente hacia abajo y la aplastamos con el rodillo . Metemos al estufa 60 ºC hasta que la tira quede transparente.

Resultado.

Resultado de la electroforesisis.

No tiene ninguna anomalía.

Hoja de trabajo.

1º. ¿De qué material son las tiras empleadas en esta técnica ?

2º. ¿Cuál es el decolorante del rojo Ponceau ?

El decolorante es una solución acuosa de ácido acético al 5 %.

3º. ¿Cómo se llama el aparato que lee las bandas de las tiras y las transforma en curvas de área mensurable?

Se llama fotodensitómetro.

4º. ¿En qué enfermedad aparece una banda electroforética de Hb S?

En la anemia falciforme heterocigótica.

5º. ¿Cuál es la Hb normal más electronegativa?

Hb A2