Práctica XVII: P3 (19/01/2015)

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE HEMOGLOBINA IVD.

Fundamento.

Esta práctica se basa en obtener unos valores mediante el espectrofotómetro.

Materiales.

• Tubo de ensayo.
• Pipeta.
• Micropipeta.
• Vaso de precipitado.
• Espectrofotómetro.

Reactivos.

Hemoglobin 50x

Ferricianuro de potasio   0,60 mmol/L. Cianuro de potasio           77 mmol/L. Dihidrogeno fosfato de potasio   2 mmol/L.

Hemoglobin cal

Patrón de hemoglobina 15 g/ dL

Hemoglobin cal.

Hemoglobin 50x.

Muestra.

Sangre venosa.

Procedimiento.

Lo primero que hay que hacer es preparar el reactivo. Tenemos que preparar 250 ml de reactivo de trabajo.
Para ello debemos verter en un vaso de precipitado el reactivo, de ahí tomamos 5 ml con una pipeta y lo vertemos en un matraz aforado de 250 ml, despúes con un embudo pasamos 245 ml de agua destilada al matraz y lo enrasamos con ayuda de una pipeta pasteur hasta la señal.

 Tomamos los 5 ml de reactivo.

Tomando el agua destilada.

Después de la preparación del reactivo de trabajo (RT) tenemos que tomar 4 tubos de ensayo y escribir a uno blanco, a otro patrón, a otro muestra 1 y al último muestra 2 y en un vaso de precipitado añadir reactivo de trabajo. Tenemos que añadir con una pipeta 5 mL de reactivo de trabajo a cada uno de los tubos de ensayo (blanco, patrón, muestra 1 y muestra 2), le añadir 10 microlitros del calibrador al tubo nombrado como patrón eso lo realizamos con una micropipeta y por último añadimos 10 microlitros de muestra a los tubos de ensayo llamados muestra 1 y muestra 2 también con una micropipeta . Cuando añadimos aun tubo mas de una sustancia lo tenemos que mezclar con ayuda de una micropipeta.

Lo dejamos 3 minutos a temperatura ambiente , pasado este tiempo lo llevamos al espectrofotómetro.

	Blanco.	Patrón.	Muestra 1.	Muestra 2.
RT (mL)	2,5	2,5	2,5	2,5
Calibrador (uL)	--	10	--	--
Muetra (uL)	--	--	10	10

Estando en el espetrofotómetro lo primero que hacemos después de prenderlo es poner la fecha y aplastar enter, pulsamos el número 1 ( absorbancia ), pulsamos el número 1 (monocromática), pulsamos el número 5 (540 nm ) y enter , volumen muestra pulsamos número 100 y enter, tiempo pulsar el número 0 y enter, temperatura pulsar el número 0 y enter, después introducimos el blanco y pulsamos PUMP , introducimos el patrón y pulsamos PUMP, introducimos muestra 1 y pulsar PUMP y por último introducimos la muestra 2 y pulsar PUMP y lo último que introducimos en agua destilada y mantenemos pulsamos WASH hasta que absorba toda el agua. Cuando introducimos el blanco RT, patrón, blanco muestra y muestra tenemos que esperar hasta que lo absorba dos veces para retirarlo y en cada absorbida saldrá unos valores que son los resultados.

Por otra parte cuando ya tenemos uno de los tubos de ensayo con 0,5 ml de patrón con una micropipeta de 500 uL, lo que debemos de hacer es tomar 0,25 ml del primer tubo y añadirlo a otro tubo diferente y ha este tubo se el añade 0,25 ml de agua destilada y por último tomamos 0,25 ml de este último tubo lo añadimos a un tercer tubo y a este se le añade 0,25 ml de agua.Finalmente estos tres tubos patrones se llevan al espectrofotómetro para obtener el resultado de su absorbancia. 

Resultado.

Patrón 15 g/dL =0,132
Patrón 1/2=0,059
patrón 1/4 = 0,049

Patrón1 ------ > [Hb] = 15 g/dL. ; A540 = 0,136

Patrón 2-------> [Hb] = 7,5 g/dL ; A540 = 0,069

Patrón 3--------> `[Hb] = 3,75 g/dL ; A540 = 0,056

La recta.

Cálculos:
Muestra = 0,056.

• Con factor.

(A) Muestra x 36,77 = g/dL de hemoglobina en la muestra.
(A) 0,056 x 36,77=2,05912 g/dL de hemoglobina en la muestra.

• Con patrón.

((A) Muestra / (A)Patrón ) x 15= g/dL de hemoglobina en la muestra.

(0,056 /0,069) x 15 =12,174 g/dL de hemoglobina en la muestra.

Hoja de trabajo.
1º ¿ En qué se basan los métodos de determinación de la hemoglobina?
Se basa en la transformación de la hemoglobina en cianmetahemoglobina mediante los siguientes pasos:
En primer lugar el Fe 2+ de la hemoglobina, en presencia de ferricianuro potásico, se oxida a Fe3+ , dando lugar a la metahemoglobina.
Posteriormente, y en presencia de cianuro potásico, la metahemoglobina pasa a cianmetahemoglobina. Éste es un compuesto estable, de color rojo, con un pico de absorción máximo a 540 nm y cuya concentración puede ser determinada por métodos colorimétros empleando un patrón de concentración conocida.

2º¿ Cuál es el método recomendado por el Comité internacional para la estandarización de la Hematología ?
El comité internacional para la estandarización de la hemoglobina recomienda el método colorimétrico de la cianmetahemoglobina por su exactitud y precisión, y por la posibilidad de utilizar un patrón de referencia internacional muy estable que sirve para verificar los resultados obtenidos en el laboratorio, y elaborar curvas de calibración.


Valoración de los resultados.
El resultado esta dentro de los valores normales.